[发明专利]产1,3－丙二醇氧化还原酶的工程菌及其酶制备方法

说明书

发明技术领域

本发明涉及一种产1，3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌及其1，3-丙二醇氧化还原酶制备方法，也即一种产PDOR的基因工程菌及其PDOR制备方法。属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，下称1，3-PD)是一种重要的环保型化工原料，主要是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体，在地毯、工程塑料、服装面料等领域用途广泛，在国际市场上供不应求。1，3-PD的合成有化学法和生物法两种。目前，生物法生产1，3-PD虽还处于实验室研究或中试阶段，但从环境保护及长远发展来看，生物法更具有生命力。1999年Biebl等人在德国《应用微生物和生物工艺学》(52卷289-297页)中总结，已发现几种能以甘油为底物发酵生产1，3-PD的菌种，主要有肠道细菌中的克雷伯肺炎杆菌属(Klebsiella pneumoniae)、产气克雷伯菌属(Klebsiella aerogenes)、肠细菌属(Enterobacter agglomerans)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)以及乳杆菌属的短乳杆菌(Lactobacilli brevis)和布氏乳杆菌(Lactobacilli buchneri)、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridia pasteuianum)等。Deckwer于1995年在欧洲《FEMS微生物综述》(16卷143-9页)中提出，K.pneumoniae、C.butyricum和C.freundii具有较高的1，3-PD转化率及生产能力，是研究得比较多的三种菌。C.butyricum具有良好的1，3-PD耐受力，但是该菌属于严格厌氧菌，培养条件苛刻。K.pneumoniae属兼性厌氧菌，属于病原菌，但实验所用菌株较为温和，在实验室范围内未见有其致病的报道，因此是比较适宜的1，3-PD生产菌。

1998年Ahrens在美国《生物工程与工艺》(59卷第5期544-552页)上发表，甘油转化为1，3-PD的厌氧代谢途径中，甘油沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中，甘油在依赖于NAD⁺的甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase，下称GDH，EC 1.1.1.6)的作用下形成二羟基丙酮(dihydroxyacetone，下称DHA)，再在二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，下称DHAK，EC 2.7.1.29)的作用下，生成二羟基丙酮磷酸(digydroxyacetonephosphate，下称DHAP)，然后进入糖酵解途径，这一代谢过程是以甘油为底物生长的微生物的共同代谢途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B₁₂为辅酶的甘油脱水酶(glyceroldehydratase，下称GDHt，EC 4.2.1.30)的作用下生成3-羟基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，下称3-HPA)，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(1，3-propanedioloxidoreductase，下称PDOR，EC 1.1.1.202)的作用下形成1，3-PD。还原途径所需的NADH由氧化途径提供，整个过程伴随着辅酶I的再生。在甘油转化成1，3-PD的过程中，GDH、GDHt和PDOR是关键酶，它们的活力与1，3-PD的产率密切相关。

GDH、GDHt和PDOR是由dha操纵子上的不同基因编码的，已有人利用基因工程技术对菌种进行改造，Tong(1991年美国《应用环境微生物》57卷3541-46页)将来自于Klebsiellapneumoniae的dha操纵子在大肠杆菌中表达生产1，3-PD，Rolf在1995年美国《细菌学》(177卷2151-6页)中发表，将Citrobacter freundii上的1，3-丙二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，但从成本和生产能力上看都达不到工业生产的要求。另外，杜邦公司申请了用单一微生物由葡萄糖发酵制备1，3-PD的专利(《一种高浓度生产1，3-丙二醇的生物法》2001年美国专利，WO.01/12833 A2)。

发明内容

本发明的目的是提供采用基因重组的方法构建能高产PDOR的工程菌，其生产成本低、生产能力高、能达到工业生产的要求；并提供其较低成本的发酵生产PDOR的方法。

本发明以如下方式实现：

1、菌种和质粒