[发明专利]OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法

摘要

本发明公开了OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法，属于植物组培快繁技术领域。该方法包括：培养基的配制，取百合种源鳞茎茎尖为外植体，经诱导、增殖、鳞茎膨大培养、冷藏、移栽、病毒检测等步骤，快速获得大量脱毒组培苗。本发明通过调节培养基的配方，并采用二次茎尖热处理脱毒与诱导培养等技术，达到不经愈伤组织生长阶段而直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，防止了种性变异，缩短了诱导培养周期，具有脱毒彻底，增殖系数高，生产成本较低，实用性强等特点，可在百合等植物脱毒组培生产中推广应用。

主权项

1、OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)培养基的配制、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：a)基本培养基：诱导、增殖培养基选用白糖为30～50g/L，琼脂粉为4～5g/L的MS基本培养基，pH为5.6～5.8；试管鳞茎膨大培养基选用白糖为70～90g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，另加甘露醇1.0～5.0g/L，AC 1.0～5.0mg/L，pH为6.0；b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；d)增殖培养基：MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；e)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.1～0.5mg/L；(2)外植体热处理和灭菌：取经过5℃低温处理3～4个月，打破休眠后的OT型杂交百合种源鳞茎，用透气塑料薄膜包裹后置在潮湿泥炭中，于50℃培养箱内热处理70～90分钟，剥离外层鳞片，取3～5cm长的鳞茎芽，用水清洗后，进行灭菌处理；(3)诱导培养：取步骤(2)0.2～0.3mm茎尖作为外植体，植于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，经2个月培养，直接诱导成鳞茎芽和/或无根组培苗；切去叶片，将鳞茎纵向切成2块，转接至诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，诱导出多个鳞茎芽，经2～3个月培养全部形成无根组培苗；将无根组培苗放入光照培养箱内按30、35、38℃的顺序，每3d变换一档，循环热处理50～60d后，取0.2～0.3mm茎尖接种在诱导培养基II上，进行第二次茎尖脱毒培养，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，经2～3个月培养，直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，然后将它们直接放入3～5℃低温处理45～60d，以提高组培苗生长活性；(4)增殖培养：将步骤(3)低温处理后的鳞茎芽或无根组培苗，切去叶片和部分基部组织后的鳞茎，纵切成4～6块，接种在增殖培养基上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下培养2个月，形成健壮的鳞茎芽和/或无根组培苗；(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，接种在鳞茎膨大培养基中，在20±2℃和黑暗条件下培养60～70d，长成直径0.8～1.2cm，根系5～10条/粒，重0.5～1.0g/粒的试管鳞茎；(6)冷藏：取出步骤(5)试管鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于消毒泥炭中，经10～12℃预处理10～20d，再经3～5℃冷藏处理50～60d打破休眠，打破休眠的鳞茎可在2～3℃下延长贮藏2～3个月；(7)移栽：将步骤(6)鳞茎，选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上，定植30～35d后出苗；(8)病毒检测：采用RT-PCR检测法，对步骤7)脱毒组培苗进行LSV、LMoV病毒检测，检测结果未发现病毒的侵染。