[发明专利]由原核细胞制备活性t－PA的技术

摘要

本发明为一种高表达含多个二硫键的非糖大分子蛋白质或糖基对其功能无重要影响的蛋白质的原核细胞表达系统。更具体的是用于表达有生物活性的突变型人纤维蛋白溶酶元激活剂(mt－PA)的原核细胞表达系统，其主要特征为：1)突变型人纤维蛋白溶酶元激活剂表达序列(mt－PA)；2)构建由阿拉佰糖(arabinose)操纵子P_BAD启动子和其调控基因araC组成的表达调控元件的、含有细菌OmpA分泌信号肽的原核表达载体及其表达mt－PA的表达质粒；3)构建同分异构酶DsbC或无信号肽DsbC的表达质粒；4)表达质粒mt－PA和DsbC或无信号肽DsbC的表达质粒共转化trxB/gov突变的感受态宿主菌，构建成高水平表达、有生物活性的分泌型人mt－PA工程菌。

主权项

1.一种由原核细菌跨膜信号肽OmpA融合mt-PA的表达序列，由阿拉佰糖(arabinose)操纵子PBAD启动子和其调控基因araC组成表达调控元件的表达质粒。其主要特征为：a).人组织型纤维蛋白溶酶元激活物(t-PA)的分子中与纤维蛋白溶酶元激活物抑制因子1(PAI-1，下同)结合区域中位于P区氨基酸296-299 lys-His-Arg-Arg突变成Ala-Ala-Ala-Ala，并在突变区形成新的Not1内切酶位点的突变型人mt-PA(下同)，其他氨基酸及其排序与野生型t-PA一致；b).人mt-PA的N-末端以Nco1酶切点连接于原核表达载体pBAD33分泌信号肽OmpA的C-末端，分泌信号肽OmpA的N-末端含有核糖体结合位点的核苷酸序列-AGGAGG-；分泌信号肽OmpA由24个氨基酸组成；c).本发明所用的原核表达载体pBAD33为新构成的含有核糖体结合位点(-AGGAGG-)分泌信号肽OmpA的原核细胞表达载体pBAD33。此分泌信号肽OmpA分别以N-端的Hhe1和C-端的Sac1连接于原型表达载体，成为由阿拉佰操纵子的PBAD启动子驱动、具有紧密调控和高水平表达的一种分泌型原核细胞表达载体。