[发明专利]一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法

摘要

本发明涉及一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，是以种间杂交组合白河－35－1×佳利酿的双亲及F₁代、F₂代为试材，用随机引物OPS03进行扩增，获得约1300对碱基的脱氧核糖核酸片段，对该片段用pGEM－T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α，克隆该片段。经测序，该片段为1365对碱基。按照该序列，人工合成的一个寡聚核苷酸能检测亲本、杂种、欧洲葡萄及野生葡萄抗黑痘病基因的存在与抗黑痘病性状的表达，用作检测葡萄抗黑痘病基因的探针。本发明的分子标记可用作葡萄抗黑痘病育种的早期筛选鉴定；其碱基序列为研究葡萄抗黑痘病基因提供了依据；人工合成的寡聚核苷酸序列具检测葡萄抗黑痘病基因存在与表达的功能。

主权项

1.一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，其特征是采用以下技术操作步骤进行：1.a以葡萄抗黑痘病育种的种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲及F1代、F2代为试材，提取、分离、纯化脱氧核糖核酸(DNA)1.b用脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行RAPD扩增1.c获得与葡萄抗黑痘病基因连锁的脱氧核糖核酸(DNA)的片段1.d用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取纯化该脱氧核糖核酸(DNA)片段1.e以pGEM-T载体连接脱氧核糖核酸片段1.f转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA进行酶切1.g将鉴定为阳性克隆的菌液测定该DNA片段的碱基构成及其序列1.h获得1365碱基对的DNA片段的全部碱基组成及其序列1.i进一步依据1365碱基对的全部碱基组成及其序列1.j人工合成4个寡聚核苷酸，其中之一(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)可用作引物，对脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增1.k对原杂交组合双亲及其F1代、F2代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F1代分别进行扩增1.l获得特异性脱氧核糖核酸(DNA)片段1.m用上述方法回收、克隆、测序该DNA片断1.n获得了另一个检测葡萄抗黑痘病性状的脱氧核糖核酸(DNA)序列，其大小为1110碱基对1.o确定获得的寡聚核苷酸序列(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作为检测葡萄抗黑痘病基因的探针。