[发明专利]化学胁迫法分离纯化勤奋金属球菌

摘要

一种分离勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)的方法。将待分离样品在含有化学胁迫剂的培养基A中，于75℃下连续震荡富集二次，得到富集物B，再在70℃下连续震荡富集三次，得到富集物E，然后在相同条件下连续进行四次震荡稀释分离，最后得到稀释物即纯化的M.sedyla菌株。本发明选用勤奋金属球菌具有较高抗性，而对其它细菌和真菌都具有较高毒性的化学胁迫剂，在富集和纯化过程中造成强大的化学胁迫效应，对勤奋金属球菌进行定向富集和纯化，突破了一般稀释法难以分离勤奋金属球菌的难点。该方法主要适用于金属球菌属(Metallosphaera)古生菌的分离纯化。

主权项

1.一种分离勤奋金属球菌的方法，其特征在于：该方法首先按10％的接种量将样品加到培养基A中，加入0.5μM尼日利亚菌素，在75℃下震荡培养120～168小时，在相同温度下密闭静置48小时，得富集物A；按10％的接种量将富集物A转接入新鲜的培养基A中，并向该培养基中加入1.0μM尼日利亚菌素，在相同温度下震荡培养120小时，得到富集物B；将富集物B仍按10％接种量接入含有1.0μM尼日利亚菌素和5.0μM 2，4-二硝基苯酚的培养基A中，在70℃下震荡培养96小时，停止震荡，静置24小时，此为富集物C；按10％接种量将富集物C接入新鲜培养基A，其中含1.5μM尼日利亚菌素和10.0μM 2，4-二硝基苯酚，继续在70℃下震荡培养96小时，得到富集物D；按10％的接种量将富集物D接入培养基B中，加入1.5μM尼日利亚菌素和15.0μM 2，4-二硝基苯酚，70℃震荡培养96小时，按相同接种量，更换同样的新鲜培养基，继续培养72小时，得到富集物E，此为最终富集物；将富集物E按10-8、10-9、10-10稀释度，分别接入培养基B中，在70℃下进行震荡稀释分离，用重铬酸钾法滴定亚铁含量，直接计数法计数活细胞数，当亚铁氧化率达90％以上，菌数达5×107/ml时，停止培养，选择稀释倍数最高的培养物作为稀释物；如此反复再稀释分离三次，最后得到的稀释物即纯化的M.sedula菌株；所述培养基A为：(NH4)2SO4 1.0g/l，MgSO4·7H2O 0.25g/l，KH2PO4 0.25g/l，酵母提取物0.01％(w/v)，FeSO4·7H2O 2mM，pH2.0；所述培养基B为：(NH4)2SO4 3.0g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，K2HPO4·3H2O0.5g/l，KCl 0.1g/l，Ca(NO3)20.01g/l，酵母提取物0.02％(w/v)，FeSO4·7H2O10mM，pH1.6。