[发明专利]筛选苏云金杆菌杀线虫菌株的方法

摘要

一种筛选苏云金杆菌杀线虫菌株的方法，以Bt为供试菌株，以秀丽小杆线虫为靶标害虫，采用浸泡生测、培养基生测、蛋白晶体生测等方法筛选高毒力杀线虫BT菌株，克服了线虫生测中遇到的难以培养的问题，采用了更容易获得的缺陷型大肠杆菌JM109，缩短了筛选周期。采用本发明的方法筛选BT高毒力杀线虫菌株的全过程只需几天的时间，不仅节约了成本，而且提高了筛选效率。筛选的BT杀线虫菌株IPS，作用24h其LC₅₀为1.008μg/ml。

主权项

1.一种筛选苏云金杆菌杀线虫菌株的方法，以Bt为供试菌株，以秀丽小杆线虫为靶标害虫，其特征在于采用线虫生测法筛选，包括以下步骤：(1)浸泡生测：以卵、幼虫期线虫为靶标害虫，培养8-10h后的Bt菌株培养液，1000-1500r/min离心，上清进行室内感染；将含100-150条健康线虫的水悬液，分别和等体积的待测菌液于凹玻片上充分混合，以去离子水为对照，于生化培养箱中保湿，25℃，24-36h后以针刺法判定线虫的死活，每处理重复3-5次，选择杀线虫活性强的Bt初筛菌株备用；(2)培养基生测：置大肠杆菌JM109于LB中在摇床中摇8-10h，再将所述Bt初筛菌株活化24-36h，收集活化的大肠杆菌JM109和Bt初筛菌株，离心，菌液浓缩至500-1000ul，均匀涂布在NGM平板上，每处理重复3-5次；将健康线虫挑到各个涂布Bt初筛菌株的NGM平板上；以涂布大肠杆菌JM109的NGM平板为对照，24-36h后，选择杀线虫活性强的Bt菌株备用；(3)蛋白晶体生测：将所述杀线虫活性强的Bt菌株接种于1/2液体LB中，28-35℃，250-300r/min培养72-84h，10000-12000r/min离心收集菌体，再用无菌水洗3-5次，得Bt菌株晶胞混合物；(4)筛选高毒力杀线虫菌株：采用96孔微量培养板，在每孔中加入100-150尾健康线虫；将所述Bt菌株晶胞混合物按照倍比浓度稀释法分别加入到培养孔中，稀释液为DDW，使每孔总体积达到500-1000μL。每一菌株设置3-5个重复，半数致死浓度LC50最低的菌株，即为供试菌株中杀线虫活性最强的Bt菌株。