[发明专利]豌豆细菌性萎蔫病菌实时荧光PCR快速检测方法

摘要

本发明公开了一种豌豆细菌性萎蔫病菌实时荧光PCR快速检测方法，其检测步骤为：1.材料：豌豆细菌性萎蔫病菌；2.试剂：DNA聚合酶，基因克隆载体；3.豌豆细菌性萎蔫病菌DNA的提取；4.引物设计与合成。5.实时荧光PCR检测反应：6.实时荧光PCR检测的特异性；7.实时荧光PCR检测的灵敏度；8.检测结果：PCR产物的克隆及鉴定。本发明能够实时快速检测豌豆细菌性萎蔫病菌，准确性高、灵敏度高，时间短，不易出现漏检，避免了疫性的逃逸和扩散。并无需对PCR产物进行其无害化处理，可以有效地解决溴化乙锭的环境污染问题等。

主权项

1、豌豆细菌性萎蔫病菌实时荧光PCR快速检测方法，其特征在于：其检测步骤如下：(1)材料：豌豆细菌性萎蔫病菌；(2)试剂：DNA聚合酶，基因克隆载体；(3)豌豆细菌性萎蔫病菌DNA的提取：挑取培养基上细菌菌落至液体培养基，28℃过夜振荡培养，波长600nm时吸收度值在0.4-0.8时，提取细菌DNA，或将细菌煮沸5分钟，裂解释放DNA；(4)引物设计与合成：引物1：CTGCCCAGACCCACCAATT和引物2：TGAAAGAGGTGCCCGGTCTA豌豆细菌性萎蔫病菌16S～23SrDNA间隔序列基因的保守序列获得，预期PCR产物为270bp；在引物对扩增片段区间找出豌豆细菌性萎蔫病菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计软件设计豌豆细菌性萎蔫病菌特异探针：TGATCCTGATGATCAGTGCCTGAATGTTGA，探针采用化学合成标记方法，5’端标记荧光染料，3’端标记淬灭荧光染料；(5)实时荧光PCR检测反应：将样品放入荧光PCR仪ABIPRISM7900型的96孔反应板上打开控制软件，按PCR循环参数，94℃预变性3min，94℃变性40s；退火温度设为：54℃，时间40s，72℃延伸1min，循环扩增反应40次，设置PCR反应条件，PCR扩增体系：10×Buffer2.5u1，25mmol/L Mgcl22.5ul，2.5mmol/L dNTP 2u1，5U/ulDNA聚合酶0.4ul，上、下游引物各1u1(10pmo1/u1)，探针2ul(10pmo1/u1)，DNA模板2u1，无菌超纯水补充至25ul；从凝胶中回收PCR电泳产物并纯化，与基因克隆载体在连接酶的作用下，16℃连接40min，将上述连接产物10ul与100ul大肠杆菌B21感受态细胞混合转化，并涂布于含氨苄青霉素的固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落在含氨苄青霉素的液体培养基中37℃过夜培养；提取细菌质粒DNA，将含PCR扩增特异片段的重组质粒送往大连宝生物工程有限公司测序；(6)实时荧光PCR检测的特异性：将豌豆细菌性萎蔫病菌以PCR循环参数反应体系进行实时荧光PCR扩增反应，观察反应结果；(7)实时荧光PCR检测的灵敏度：将109CFU/mL菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7做梯度稀释，煮沸5分钟，裂解释放DNA，以1.4.2反应体系(循环40次)进行PCR扩增反应；(8)检测结果：PCR产物的克隆及鉴定：豌豆细菌性萎蔫病菌目的基因克隆片段长270bp，将测序结果与基因库中的序列用进行同源性分析，结果表明本试验的克隆片段发表的相应片段具有100％的同源性；利用引物1和引物2及荧光探针，对豌豆细菌性萎蔫病菌菌株进行实时荧光PCR检测，具有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，将含菌量为108CFU/mL(Beckman紫外分光光度计检测)浓度的豌豆细菌性萎蔫病菌纯培养悬浮液以10倍梯度稀释7次后，各取4ul直接进行实时荧光PCR检测和常规PCR扩增，结果表明，在稀释菌液为103CFU/mL时，实时荧光PCR仍可检测到豌豆细菌性萎蔫病菌，其稀释限点应为103CFU/mL。