[发明专利]一种稳定同位素标记的15N－L－天冬氨酸的制备方法

摘要

本发明涉及一种稳定同位素标记的该制备方法包括以下工艺步骤：(1)发酵产酶所采用的微生物：大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 11303或CGMCC 1.881；(2)斜面培养；(3)发酵培养；(4)酶反应；(5)提取精制及本发明已建立起一套实验室规模的生产工艺，体现出了酶法制备¹⁵N－L－氨基酸的优越性，有利于¹⁵N利用率的提高及后提取工艺的简化，减少了生产成本，提高了产品品质，以较高的的产品，且提取得率很高，大大提高了产品的市场竞争力。

主权项

1.一种稳定同位素标记的15N-L-天冬氨酸的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下工艺步骤：(1).发酵产酶所采用的微生物：大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11303或CGMCC 1.881；(2).斜面培养：培养基为营养肉汁琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，蒸馏水1.0L，pH值6.8～7.2，定容至1.0L，分装，0.1MPa(121℃)灭菌20分钟，菌种接入后28℃～32℃培养16～24小时；(3).发酵培养：以碳源、氮源、微量元素离子配置成发酵培养基，调节其pH值5～9，灭菌后接入大肠杆菌斜面种子，于150～260rpm，22℃～40℃，培养16～24小时；装液量为50ml/500ml，灭菌条件为0.1MPa(121℃)，20分钟；菌体的生长浓度通过分光光度法加以分析；(4).酶反应：底物反应液(g/L)：底物反丁烯二酸的浓度为50g/L～200g/L，以100g/L～150g/L为较佳，加入微量元素离子及15N氮源后用NaOH调节pH值为7.5～9.5；将发酵所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量0.5重量％～1.2重量％，在30℃～50℃下，更适宜的35℃～40℃反应20～28小时，中间经取样以分光光度法测试反丁烯二酸的浓度小于0.25重量％时停止反应；反应过程中及最终反应结束时反丁烯二酸的浓度通过紫外分光光度法来测定，从而可计算出转化率；(5).提取精制及15N的回收：反应结束后，将酶反应液进行离心，上清液于旋转蒸发仪上赶氨浓缩，所溢出氨加以吸收回收，直至冷凝液pH值为6.5～7.5；然后将该溶液加热至75℃～85℃，加入0.2～0.8重量％活性炭脱色30～45分钟，过滤得无色滤液；将滤液置于恒温磁力搅拌器或旋转蒸发仪上加以浓缩至原来体积的1/5～1/3，待温度维持在60℃～70℃，加入盐酸等酸调节pH值至2.80～3.00，逐渐有晶体析出；冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃～60℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到15N-L-天冬氨酸产品；15N的摩尔转化率在70％以上，最终15N的利用率达65.99％；等电点母液浓缩后可再调pH值或再上柱提纯又可得到产品；对反应残余的15N原料的回收达80％以上。