[发明专利]鸡传染性贫血病毒PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒PCR检测方法，采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入缓冲液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，将试剂混合均匀后，置于PCR扩增仪中，进行变性、退火、延伸共循环30～35次；PCR反应结束后，取10μL产物在琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，并与标准分子量相对照，阳性样品可出现925bp片段。本发明对CIAV进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测CIAV提供了便利条件。

主权项

1.一种鸡传染性贫血病毒PCR检测方法，其特征是，(1)CIAV DNA的提取：即取100mg的组织，加入1000μL TEN缓冲液，充分研磨后，反复冻融3次，7000rpm离心10分钟，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均匀后置37℃消化过夜或50℃水浴3小时。之后加入等量酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2体积预冷的无水乙醇于-20℃30分钟，12000rpm离心15分钟。沉淀颗粒置真空干燥箱干燥后，用适量超纯水溶解，即为实验用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用。(2)设计并合成引物：上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超纯水溶解，浓度为100pmol，置于-20℃保存备用。(3)PCR反应体系：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加人10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(各2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，混合均匀。(4)PCR反应条件：将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环，反应条件是：94℃，3分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，62℃，1分钟，72℃，3分钟共循环30～35次；最后72℃延伸10分钟。(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在0.7％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小。(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，阳性样品可出现925bp片段。