[发明专利]一种植物DNA病毒侵染性载体构建方法

摘要

本发明涉及一种植物DNA病毒侵染性载体的构建方法。以中国番茄黄化曲叶病毒云南分离物为材料对基因组DNA－A和一新型的卫星分子DNAβ进行了侵染性克隆的构建，通过Overlap－PCR和酶切的方法获得两个正向重复的基因组，并插入到具有高度复制能力的植物表达载体，重组载体通过三亲交配的方法导入具有强感染力的农杆菌菌株，从而获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效感染能力的侵染性载体。本发明为病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒之间的互作研究、外源蛋白的表达载体以及病毒诱导的基因沉默的植物功能基因组研究提供了成熟的方法和体系。

主权项

1.一种植物DNA病毒侵染性载体的构建方法，其特征在于，其步骤为：1)从收集的双生病毒发病株中提取基因组总DNA；2)以植物总DNA为模板，设计简并引物对双生病毒的两个组分DNA-A和DNAβ进行PCR扩增，扩增产物克隆至T-Vector；3)对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行序列测定；4)序列测定结果通过DNA分析软件进行组合、拼接，获得DNA-A组分和DNAβ组分的全长基因组序列；5)在序列测定的基础上，利用Overlap-PCR和限制性酶切的方法把DNA-A组分的1.7个重复的基因组构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNA-A组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；6)使用5)中相同的方法把两个正向重复的DNAβ组分构建到改良型植物表达载体上，获得带有DNAβ组分的重组植物表达载体，并将其导入大肠杆菌细胞；7)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中的带有DNA-A组分的重组植物表达载体和带有DNAβ组分的重组植物表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105；8)重组载体导入农杆菌菌株以后，带有DNA-A和DNAβ的农杆菌接种5mlYEP液体培养基培养；9)侵染性测定时，试验植株选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株为宜，接种组合为单DNA-A接种，单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种；10)接种时，取1ml一次性针筒吸取农杆菌菌液对植株进行伤口感染，接种的具体方法和部位：在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在叶片的叶柄处取三点进行注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头对叶脉产生伤口使菌液进入植株体内；11)接种植株置于25℃隔离温室培养，10-30dpi后观察接种植株的症状；12)对出症状和没有出症状的植株进行ELISA、PCR和SouthernBlot检测以鉴定其侵染性。