[发明专利]大豆过氧化物酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种大豆过氧化物酶的制备方法，其分离纯化步骤如下：新鲜的大豆壳抽提液经高速离心，取上清液，用固体硫酸氨分级，沉淀；经DEAE－SephadexA－50离子交换柱层析，Bio－GelP－60凝胶过滤，DEAE－SephadexA－25二次离子交换和SephadexG－100凝胶过滤、纯化，制得大豆过氧化物酶。该酶由一条多肽链组成，分子量约为38,000，酶的等电点为3.9，其RZ＞2.8。该方法具有纯度高、活性高的特点，且离子交换柱和凝胶柱可多次使用，有效地降低了SBP的制备成本。

主权项

1.一种大豆过氧化物酶的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：第一步：将新鲜的大豆壳按固液1∶5的比例浸泡于pH5-8的20mmol/L磷酸缓冲液中，以5000-9000转/分用组织捣碎器搅碎，0-4℃条件下浸泡10-48小时，过滤；第二步：将上述滤液以5000-10000转/分离心30-50分钟，取上清液，加固体硫酸氨分级，沉淀；第三步：将30％-80％饱和度的沉淀对pH5-8的20mmol/L磷酸缓冲液透析，然后超滤浓缩；第四步：取上述浓缩液经DEAE-SephadexA-50离子交换柱层析，0-1.5mol/LNaCl梯度洗脱，测定280nm紫外光吸收和酶活力，合并有酶活力的部分；第五步：取上述有酶活力的部分对pH5-8的20mmol/L磷酸缓冲液充分透析，超滤浓缩，经Bio-GelP-60凝胶过滤，测定酶活力，合并有酶活力的部分；第六步：取上述有酶活力的部分对pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸缓冲液透析，浓缩。用同一缓冲液平衡DEAE-SephadexA-25离子交换柱，然后，将浓缩液过柱，0-0.6mol/LNaCl梯度洗脱，测定280nm紫外吸收和酶活，收集有酶活的部分；第七步：取上述有酶活力的部分对pH4.5-6.0的20mmol/L醋酸缓冲液透析，浓缩，再经SephadexG-100凝胶过滤，合并有酶活力的部分，制得大豆过氧化物酶，该酶由一条多肽链组成，分子量为38,000，酶的等电点为3.9，其RZ＞2.8；在上述制备大豆过氧化物酶的方法中，第四步、第五步和第六步的顺序可以颠倒。