[发明专利]氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片的制备方法

摘要

本发明公开了一种氨酰基转运核糖核酸(tRNA)合成酶识别型蛋白芯片的制备方法，它适用于蛋白质中基本氨基酸组分的检测。其特征在于将组成蛋白质的20种基本氨基酸对应的氨酰基转运核糖核酸合成酶(AARS)以阵列形式固定到芯片表面，再在一定条件下把20种荧光标记的转运核糖核酸固定到相应的合成酶上去，形成转运核糖核酸－氨酰基转运核糖核酸合成酶芯片。该芯片就可利用氨酰基转运核糖核酸合成酶对其相应氨基酸的特异识别作用来检测该种氨基酸在蛋白质中存在与否。最后综合20个样孔的反应情况，应用荧光扫描可检测出蛋白质中氨基酸的组成。本发明具有准确，灵敏，快速，方便的特点。

主权项

1、一种氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片的制备方法，包括下列步骤：A、制备荧光物质IAEDANS标记的转运核糖核酸；B、把精氨酰转运核糖核酸合成酶基因和strep-tag序列进行基因重组，并合成精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白，回收后用液闪记数仪来检测其活力；C、向表面修饰有亲和素的芯片样孔中加入反应试剂，使其终浓度为精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白50到100nmol/L，氯化钠为150nmol/L，乙二胺四乙酸钠为1mmol/L，在PH8.0，20℃条件下温浴20分钟，使精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白固定到芯片表面，再用无菌水清洗，4℃晾干；D、向固定化精氨酰转运核糖核酸合成酶的样孔中加入反应试剂，使其终浓度为Tris/盐酸50mmol/L，氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L，荧光IAEDANS标记的精氨酸转运核糖核酸534μmol/L，在PH7.4，37℃下温浴5到7分钟，使精氨酸转运核糖核酸分子均匀而稳定的结合到精氨酰tRNA合成酶上，后用氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片表面，4℃晾干；E、向步骤D中制备的精氨酰转运核糖核酸合成酶-精氨酸转运核糖核酸复合物中加入反应试剂，使终浓度为精氨酸0.1mmol/L，乙二胺四乙酸钠为0.1mmol/L，氯化钾80mmol/L，二硫苏糖醇0.5mmol/L，在37℃，PH7.4条件下温浴5分钟后，停止反应，以氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片；F、把甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、洛氨酸、色氨酸、组氨酸、脯氨酸相应氨酰基转运核糖核酸合成酶的基因都与strep-tag制成融合蛋白，再重复A、B、C、D、E的步骤在一块芯片的20个孔中阵列固相出20种不同的氨酰基转运核糖核酸合成酶-转运核糖核酸复合物，制成氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型芯片。