[发明专利]定量PCR和免疫PCR通用检测方法和试剂盒

摘要

本发明涉及一种定量PCR和免疫PCR通用检测方法和试剂盒，其特征是用同一改良扩增管和相应PCR扩增试剂，同时连续进行抗原抗体结合反应、靶抗原和病原体靶序列捕获、PCR扩增靶序列和质粒DNA、洗涤、特异性标记探针杂交、显色或发光反应步骤，同时连续进行定量PCR测定靶序列和免疫PCR测定靶抗原，具有简便的操作方法和灵敏、准确的优点。适用于与疾病相关的靶序列和靶抗原的同时定量测定，尤其适用于极微量病原体和标志蛋白的检测。

主权项

1、一种定量PCR和免疫PCR通用检测方法，其特征在于：用同一改良扩增管和相应聚合酶链反应扩增试剂，同时连续进行抗原抗体结合反应、靶抗原和病原体靶序列捕获、聚合酶链反应扩增靶序列和质粒DNA、洗涤、特异性标记探针杂交、显色或发光反应步骤，同时连续进行定量聚合酶链反应测定靶序列和免疫聚合酶链反应测定靶抗原，该方法包括：a)上述改良扩增管是一个高10-13mm，上口[5]口径为6-10mm，底部2-5mm呈U型或V型的改良扩增管[1]，其上有一直径5-11mm的圆形小盖[3]，小盖[3]上有卡槽或螺纹[4]与该改良扩增管[1]的上口[5]相吻合；在该改良扩增管[1]的底部包被有稳定化的特异性抗体[2]；该特异性抗体[2]是多克隆抗体、单克隆抗体和蛋黄抗体IgY中的任一种；b)捕获靶抗原和靶序列：向已包被有特异性抗体的改良扩增管中加入待检样品10-50μl，置37℃作用10-60分钟后洗涤；c)PCR扩增靶序列和质粒DNA：向上述改良扩增管中加入裂解液10-50μl 63℃保温30分钟，再加入相应聚合酶链反应扩增试剂20-50μl，进行聚合酶链反应扩增，扩增参数为：起始变性94℃2min；25-35个聚合酶链反应循环：变性94℃30s，退火56℃40s，延长70℃40s；后置延长72℃5分钟；待聚合酶链反应扩增完毕后，洗涤除去多余反应物质；上述聚合酶链反应扩增试剂包括生物素化特异性抗体10-20mg/L、游离亲和素5mg/L、生物素化靶序列引物1和2各50pmol/L、质粒DNA10-50μg/L、生物素化质粒DNA引物1和2各50pmol/L、1.5mmol/L MgCL2、0.2-0.4mmol/L4种脱氧核糖核苷酸、Taq-DNA聚合酶2U、50mol/L KCL、10mmol/L PH8.3 Tris-HCL缓冲液；d)特异性标记探针杂交：向改良扩增管中加入荧光素标记的靶序列特异性探针和地高辛标记的质粒DNA特异性探针，液相杂交90℃2-5min、55℃1-10分钟后，洗涤除去多余的标记探针；e)显色或发光定量：向上述改良扩增管中加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体和辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37℃结合30分钟，洗涤后先加入碱性磷酸酶显色剂显色，其颜色深浅与靶序列含量成正比，用酶标仪定量测定之；上述测定完成后，洗涤改良扩增管，加入辣根过氧化物酶显色剂显色，其颜色深浅与靶抗原含量成正比，用酶标仪定量测定之；或洗涤改良扩增管后，向上述改良扩增管中加入荧光显色剂，用荧光测定仪测定所显示的荧光强度，或用发光仪测量发光强度，分别与相应靶序列和靶抗原的含量成正比。