本发明公开了一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用,属于食源性致病菌分子检测技术领域。该引物组包括如下序列:扩增产志贺毒素大肠埃希氏菌基因wzx的如SEQ ID NO:1‑3所示的引物和探针;扩增单核细胞增生李斯特氏菌基因plcA的如SEQ ID NO:4‑6所示的引物和探针;扩增沙门氏菌基因hilA的如SEQ ID NO:7‑9所示的引物和探针。本发明的检测方法可以一次性同时检测上述3种致病菌,表现出耗时短,检测效率高的优势,且可以进行定量检测,能够满足规模化生产的快速检测需求,对有效预防食源性致病菌危害的发生具有重要的实用价值。