本发明提供了一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用,引物包括上游引物MA‑Pf和下游引物MA‑P,探针为MA‑Probe,序列分别如SEQ ID NO.1、NO.2和SEQ ID NO.3所示,探针的5'端标记有荧光报告基团FAM,探针的3'端标记有淬灭基团BHQ1。利用引物和探针建立的TaqMan实时荧光定量PCR能在1个反应管里同时检测曼氏杆菌属全部9个种细菌,且不与牛羊常见的细菌发生交叉反应。该方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好、检测快速、操作简便、成本低廉等优点,可用于曼氏杆菌属细菌的快速鉴定和牛羊组织样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测,为牛羊曼氏杆菌属细菌感染的高通量快速检测提供了可靠方法。