本发明公开了一种基于CRISPR的检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法及试剂盒。所述引物对根据如SEQ ID NO:1–5所示的靶位点设计得到。crRNA探针根据如SEQ ID NO:6–10所示的靶向位点设计得到。一种基于CRISPR方式检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的试剂盒,其由冻干试剂1、2,缓冲液1、2,基因组DNA提取试剂1、2,紫光手电组成。利用基因组DNA提取试剂处理菌液;通过引物对、重组酶聚合酶和dNTP,扩增靶位点基因;借助Cas12蛋白,在crRNA探针指导下,结合靶位点双链DNA底物,激活非特异性切割单链DNA报告序列的特点而设计的一种高灵敏度、高特异性的快速、可视化检测替加环素耐药高毒力肺炎克雷伯氏菌的方法。