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[发明专利]一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送工程菌株的构建方法及应用-CN201710242405.X在审
发明人：白芳;金守光;靳永新;刘颖;李振鹏;吴卫辉;程志辉 -专利权人：南开大学
申请日： 2017-04-14 - 公布日： 2017-08-29 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明涉及一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法及其应用。构建方法是，将铜绿假单胞菌PAK菌株基因组中4种毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因删除，使其对哺乳动物细胞无细胞毒性；进一步从染色体上删除抑制细菌III型分泌系统(T3SS)的popN基因，使其T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，从而构建出工程菌株Δ5。本发明构建的工程菌株Δ5可用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送，进行基因编辑，细胞重编程，蛋白质功能研究等工作。可实施递送的细胞类型广泛，包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、多能干细胞等。
一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送工程菌株构建方法应用

[发明专利]重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法-CN201210535955.8无效
发明人：吴东海;李洪波;徐爱民;金守光;李娜;李侍武 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2012-12-11 - 公布日： 2013-04-17 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明公开了一种可溶性重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法，包括以下步骤：克隆hVEGF165基因，得质粒hVEGF165/pMD20-T；构建表达载体pET32及pET28，得重组载体pET32/hVEGF165和pET28/hVEGF165；将重组载体转到宿主中，得转化子；转化子经IPTG诱导得Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白，再经镍亲和层析、PBS透析和超滤浓缩纯化；本发明以pET32、pET28为载体、优化诱导表达条件，最终高效表达Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白，既保证了两种蛋白的生物学活性，也高效地获得大量稳定蛋白。
重组血管内皮细胞生长因子 165 蛋白及其生产方法

[发明专利]Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法-CN201210415337.X无效
发明人：吴东海;李洪波;胡兴;徐爱民;李鹏;金守光;李娜 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2012-10-25 - 公布日： 2013-03-13 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明公开了一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法，主要包括以下步骤：克隆hPTN基因，得质粒hPTN/pMD20-T；构建原核表达载体，得重组载体pET32a(+)/hPTN；将重组载体转化到大肠杆菌宿主中，得到大肠杆菌表达菌株转化子；将所得转化子经IPTG诱导得Trx-hPTN融合蛋白；利用镍亲和层析、PBS透析和超滤浓缩纯化，得纯度90%以上的Trx-hPTN融合蛋白。本发明所述的生产方法，利用pET32-a(+)作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶Trx-hPTN融合蛋白的方法，既保证了Trx-hPTN融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。
trx hptn 融合蛋白及其生产方法

[发明专利]重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法-CN201210411529.3无效
发明人：吴东海;李洪波;胡兴;徐爱民;李鹏;金守光;李娜 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2012-10-24 - 公布日： 2013-02-20 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明公开一种重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法，表达宿主BL21（DE3），载体pET32-a(+)，步骤如下：克隆hIGF2基因；构建原核表达载体；可溶性的N端带有His×6标记的Trx-hIGF2融合蛋白的表达；Trx-hIGF2融合蛋白的纯化；利用带His×6标记的肠激酶对Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，得高纯度的hIGF2。本发明首次用BL21（DE3）和pET32-a(+)，实现hIGF2高效可溶性融合表达；用His×6标签及肠激酶切割技术，实现在蛋白质一级结构上，与hIGF2完全相同的重组hIGF2蛋白的制备，表达产物也具有生物活性。
重组胰岛素生长因子蛋白及其生产方法

[发明专利]幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法-CN201210112983.9无效
发明人： 金守光;杨洪江 -专利权人：天津天佛罗生物技术有限公司
申请日： 2012-04-18 - 公布日： 2012-10-10 - 主分类号： G01N33/68 文献下载
摘要：本发明涉及一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白所述底物为含有1％m/m 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和30％v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。本发明使用纯化的6种幽门螺杆菌重组毒力蛋白作为抗原，抗原本身具有高度保守性和特异性，且与患者的症状相关，因此，本试剂盒具有特异性高、区分幽门螺旋杆菌临床菌株毒力强弱、以及具有半定量检测的特点。
幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其方法

[发明专利]幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法-CN201210113718.2无效
发明人： 金守光;杨洪江 -专利权人：天津天佛罗生物技术有限公司
申请日： 2012-04-18 - 公布日： 2012-08-22 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明涉及一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，步骤如下：(1)分别扩增6种毒力蛋白基因，针对6种毒力蛋白设计引物，引物序列见序列1至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点，这6种重组毒力蛋白的N端分别携带6个His标记；(2)分别克隆6种毒力蛋白编码基因；(3)分别亚克隆6种毒力蛋白编码基因到表达载体上；(4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒力蛋白；(5)纯化。本6种蛋白编码基因或氨基酸序列具有高度保守性和特异性，并且与患者的症状相关，因此制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。
幽门螺旋杆菌毒力蛋白质制备方法

[发明专利]一种高效生产Trx-hCTRP2的方法-CN201110077595.7无效
发明人：吴东海;李洪波;金守光;徐爱民;李侍武 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2011-03-29 - 公布日： 2011-10-05 - 主分类号： C07K19/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种高效生产Trx-hCTRP2的方法，该方法主要包括以下步骤：克隆人hCTRP2基因，构建原核表达载体：表达载体pET32-a(+)和质粒hCTRP2/pMD20-T经过XhoI及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hCTRP2，转化重组载体到大肠杆菌宿主中，可溶诱导表达；纯化。本发明所述生产方法，利用pET32作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶hCTRP2融合蛋白的方法，既保证了hCTRP2融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。
一种高效生产 trx hctrp2 方法

[发明专利]一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其生成方法-CN201110009024.X无效
发明人：吴东海;李洪波;金守光;徐爱民;李侍武 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2011-01-17 - 公布日： 2011-08-17 - 主分类号： C12N15/12 文献下载
摘要：本发明公开了一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其高效生产方法，该方法主要包括以下步骤：克隆人源血小板源性生长因子A剪接体2基因；构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的PDGF-A存在糖基化和非糖基化的两种形式；利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经CM阳离子交换柱与G-75分子筛进行高效纯化，利用CM阳离子交换法通过优化透析液的pH能够有效纯化得到其中一个PDGF-A的单体被糖基化而另一个单体未被糖基化的PDGF-AA二聚体新修饰蛋白，分离纯化的PDGF-AA二聚体新的糖基化修饰蛋白具有高度的均一性。
一种血小板生长因子同源二聚体及其生成方法

[发明专利]一种人重组白介素-3的表达纯化方法-CN201110009028.8有效
发明人：吴东海;李洪波;金守光;徐爱民;李侍武 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2011-01-17 - 公布日： 2011-08-10 - 主分类号： C12N15/24 文献下载
摘要：本发明公开了一种高效表达人重组白介素-3(rhIL-3)的毕赤酵母转化子及其纯化方法，真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤：克隆人IL-3基因；构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的IL-3存在糖基化和非糖基化的两种形式；利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经镍亲合纯化后再经DEAE阴离子柱进一步纯化，纯化产物进行了质谱鉴定分析，结果表明，表达出的IL-3是经不同糖基修饰的IL-3，该IL-3含有His×6标签和C-MYC标签，易于纯化和检测表达产。本发明改变了传统的用原核宿主表达rhIL-3，首次利用毕赤酵母表达系统大量表达rhIL-3的方法，通过His-tag标签蛋白得到快速纯化，纯化的rIL-3是经不同程度糖基化的分子量分别在19kDa和22kDa的高活性rhIL-3蛋白，本方法保证了快速获得高活性的rhIL-3重组蛋白。
一种重组白介素表达纯化方法

[发明专利]一种高密度发酵生产人白细胞介素6的方法-CN200910194117.7无效
发明人：吴东海;李洪波;汪玉;金守光;徐爱民;李侍武 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2009-11-24 - 公布日： 2010-06-16 - 主分类号： C12N15/24 文献下载
摘要：本发明公开了一种高密度发酵生产人白细胞介素6的方法，真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤：(1)克隆人IL-6基因；(2)构建真核表达载体；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中；(4)通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子；(5)利用14L发酵罐，实现了人IL-6蛋白在发酵罐中高密度生长培养并实现高效分泌表达，培养物上清经PEG沉淀、DEAE阴离子交换和G-75分子筛分离，三步法，得到了纯度达95％以上的重组人IL-6蛋白。本发明改变了传统的用原核宿主大肠杆菌表达IL-6，探索出用真核宿主毕赤酵母在发酵罐中高密度培养来大量表达IL-6的方法，获得了高纯度的重组人IL-6蛋白，本方法既保证了IL-6的生物学活性，又获得了大量稳定的蛋白。
一种高密度发酵生产白细胞方法

[发明专利]高水平分泌表达人白细胞介素8的方法和酵母转化子-CN200910038971.4无效
发明人：吴东海;李洪波;金守光;许爱民 -专利权人：中国科学院广州生物医药与健康研究院
申请日： 2009-04-24 - 公布日： 2009-11-11 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明公开了一种高水平分泌表达人白细胞介素8的方法和酵母转化子，主要包括以下步骤：克隆人IL-8基因；构建真核表达载体；转化重组载体到真核酸母宿主中；通过筛选，得到了一株高水平分泌表达的酵母转化子；酵母宿主中表达重组人IL-8蛋白，经硫酸铵沉淀和CM-阳离子交换层析两步法，快速得到了纯度达95％以上的重组人IL-8蛋白。本发明改变了传统的用原核宿主大肠杆菌表达IL-8，探索出用真核宿主毕赤酵母来表达IL-8的方法，并筛选到了高水平分泌表达酵母转化子，通过硫酸铵沉淀及CM-阳离子交换层析快速获得取高纯度的重组人IL-8蛋白，本方法既保证了IL-8的生物学活性，又快速获得了大量稳定的蛋白。
水平分泌表达白细胞方法酵母转化

[发明专利]棒状链霉菌lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法-CN200410093957.1无效
发明人：王艳萍;左志晗;金守光 -专利权人：天津科技大学
申请日： 2004-12-17 - 公布日： 2005-07-27 - 主分类号： C12N15/74 文献下载
摘要：棒状链霉菌lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法，属于生物工程，涉及棒状链霉菌编码赖氨酸ε－转氨酶lat基因的PCR体外扩增引物及lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法。本发明设计了上下游引物，实现lat基因的体外大量扩增，构建了具有单交换整合能力的质粒和衍生物，对影响克拉维酸产量的棒状链霉菌的lat基因进行缺失突变，并完成在大肠杆菌中的构建工作。该质粒大小约为7.8kb或7.0kb，它包含来自棒状链霉菌中的编码赖氨酸ε－转氨酶基因的一部分及大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点、带有在大肠杆菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记，并具有pSW344E温敏型复制子基因。
棒状链霉菌 lat 基因缺失质粒衍生物及其构建方法

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