本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种检测乳酸菌的引物组、利用PMA‑qPCR检测乳酸菌活菌数的方法及应用。本发明提供了一种检测乳酸菌的引物组,所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物;所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的下游引物;所述第三引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的下游引物。本发明可以使用提供的引物组对进行qPCR分析,快速高效完成每一株乳酸菌的活菌数检测。