本发明中公开了一种质粒载体,所述质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法,将上述质粒载体进行体外转录,然后将体外转录的RNA转染BHK‑21细胞,获得鸭坦布苏病毒弱毒株。本发明同时公开由上述制备方法获得的鸭坦布苏病毒弱毒株及该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏减毒活疫苗制备中的应用。本发明制备的鸭坦布苏重组致弱病毒对鸭胚和雏鸭的毒力显著减弱,不引起任何临床症状,并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性,10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平;同时单剂量的重组致弱病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护,是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。