本发明公开了一种基于蛋白连接酶的高通量检测蛋白表达的方法,涉及生物工程技术领域,将待测蛋白、蛋白连接酶和荧光多肽底物混合,利用蛋白连接酶连接携带识别序列的目的蛋白质和荧光多肽底物,获得待测蛋白表达检测结果,蛋白连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用识别PGA(15)基序的特异性蛋白连接酶(connectase)直接将荧光多肽底物连接到目标蛋白上,利用荧光标记的多肽底物在特定波长激发荧光下,可以即刻观察到目的蛋白表达情况,基于连接酶的方法可以更快速、灵敏、和特异地检测目的蛋白情况。