本发明公开了一种检测可复制性慢病毒的探针、引物、试剂盒及其应用。所述试剂盒包括引物对和探针,所述引物对包括上游引物和下游引物,所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明建立的检测方法具有较高的灵敏度,假阳性低,可联合细胞培养法应用于CAR‑T细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞样品中的可复制性慢病毒检测,也可用于已有RCL安全性数据积累的CAR‑T细胞样本的快速放行检测,本发明的试剂盒可有效的作为细胞治疗产品生产环节中的质控手段。