本发明公开了两种配对使用的能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体,其中所述抗体命名为3A10B5,其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;另一抗体命名为7E3B6,其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了所述单克隆抗体作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备丙型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。实验证实本发明的单抗与HCV感染者血清中的NS3抗原的结合具有高度的特异性和亲和力,对丙型肝炎病毒筛查具有重要的应用价值。