本发明涉及生物活性分子检测技术领域,公开了一种基于还原石墨烯的活性氧纳米探测探针的制备方法及其应用,其制备方法为:步骤一、将活性氧传感分子RedoxSensor Red CC‑1溶解于DMSO得溶液A,氨基化还原石墨烯分散于水中得溶液B;步骤二、将所述溶液A滴入所述溶液B中,摇床振荡;步骤三、将步骤二所得物离心处理后弃上清液,然后加入去离子水并超声分散,得基于还原石墨烯的活性氧纳米探测探针。本发明制备的传感探针避免了原本探针检测的繁琐操作,降低了检测成本,提高了检测稳定性和信噪比,同时保证了荧光检测的高灵敏度特征。本发明可以实现对溶液中活性氧的快速、直接测量,应用范围广泛。