本发明涉及一种手足口病病毒的多重荧光PCR检测试剂盒、及应用,包括如下用于扩增常见手足口病病原体的引物对、以及用于质控的内标基因的引物及探针,引物及探针序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.12所示,本发明能够实现一次反应同时检测三种引起肠道系统感染的常见病原体,缩短了检测时间,准确性高,为临床和检测实验室提供了有力的检测工具;本发明对用于肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16和肠道病毒通用型的引物和探针具有良好的特异性,并且避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题;另外,本发明试剂盒设计了内标,内标模板为人看家基因,参与样本提取及PCR扩增,可有效监控整个反应过程,防止出现假阴性;并且能有效规避某些抑制剂对PCR反应的抑制。