本发明属于核酸检测技术领域,涉及一种用于双重miRNAs检测的分枝状核酸纳米探针及其制备方法和应用。本发明提供了一种用于双重miRNAs检测的分枝状核酸纳米探针,所述分枝状核酸纳米探针的组装用原料包括4条DNA链和4个发夹;所述4条DNA链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~4所示,自组装形成十字形主干;所述4个发夹的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5~8所示,与十字形主干混合自组装形成分枝状核酸纳米探针。本发明所述分枝状核酸纳米探针对于所检测靶标miRNA‑21与miRNA‑125b具有较宽的线性范围(0~100nM)和良好的灵敏度(检测限低至10fM)。