本发明提供了一种检测油菜除草剂抗性ALS基因的KASP标记引物组、试剂盒及其应用,涉及生物技术领域。本发明设计KASP标记引物组包括用于检测BnALS1基因和BnALS3基因突变位点的特异性引物和通用引物,BnALS1和BnALS3基因共用一对特异性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,BnALS1基因的通用引物如SEQ ID NO.3所示,BnALS3基因的通用引物如SEQ ID NO.4所示。本发明设计的KASP引物组能特异性区分和检测BnALS1和BnALS3基因的突变位点G或T,检测株系的除草剂抗性。本发明设计的KASP检测方法准确可靠,操作方便,适用于BnALS1和BnALS3基因抗性位点的鉴定及辅助选择育种。