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[发明专利]一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法-CN202011538923.4有效
发明人：彭昉;俞英豪;王冶陶 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2020-12-23 - 公布日： 2023-07-07 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。该扩增体系包括组分1和组分2；组分1包括灭活的基因工程细胞1、胎牛血清IL‑2和淋巴细胞基础培养基；组分2为含灭活的基因工程细胞2的淋巴细胞基础培养基；基因工程细胞1为表达CD80、IL21、IL12的滋养细胞；基因工程细胞2为表达CD80、IL12的滋养细胞。本发明利用该扩增体系与NK细胞共培养，14天获得的NK细胞的存活率达92％，NK细胞扩增倍数约5000倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；同时可以有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。
一种淋巴细胞扩增体系方法

[发明专利]一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用-CN202310061378.1在审
发明人： 王冶陶;彭昉;俞英豪 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2023-01-16 - 公布日： 2023-05-23 - 主分类号： B07C5/02 文献下载
摘要：本发明涉及一种扩增激活NK细胞的培养基组合及其制备方法和应用，所述培养基组合包括诱导培养基、扩增培养基和激活培养基；所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分、所述扩增培养基包括基础培养基和扩增组分、所述激活培养基包括基础培养基和激活组分；所述基础培养基含有血清。本发明所述培养基组合，既可以活化外周血单个核细胞中的多种免疫细胞，同时对纯化的NK细胞，也可以模拟抗原提呈细胞识别抗原后被活化的状态。三种培养基相辅相成，使得培养得到的NK细胞在扩增倍数、细胞纯度和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，且与使用滋养层细胞体外扩增NK细胞相比，该培养基组合不使用外来肿瘤细胞，安全性比较好。
一种扩增激活 nk 细胞培养基组合及其制备方法应用

[发明专利]一种NKT细胞冻存液及NKT细胞的保存方法-CN202310038662.7在审
发明人： 王冶陶;彭昉;俞英豪 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2023-01-13 - 公布日： 2023-05-23 - 主分类号： A01N1/02 文献下载
摘要：本发明涉及一种NKT细胞冻存液及NKT细胞冻存液的保存方法，所述NKT细胞冻存液的组分包括：二甲基亚砜、人血白蛋白、右旋糖酐、海藻多糖、银耳多糖和生理盐水。本发明所涉及的NKT细胞冻存液通过在生理盐水中同时加入二甲基亚砜、人血白蛋白、右旋糖酐、海藻多糖、银耳多糖，获得的冻存液大大减少了细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，能很好地增加NKT细胞的活率，细胞复苏后也有良好杀伤能力。
一种 nkt 细胞冻存液保存方法

[发明专利]一种增加NK细胞冻存复苏后活性的方法及其应用-CN202310038621.8在审
发明人： 王冶陶;彭昉;俞英豪 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2023-01-13 - 公布日： 2023-05-05 - 主分类号： A01N1/02 文献下载
摘要：本发明涉及一种增加NK细胞冻存复苏后活性的方法及其应用，所述方法包括：将待冻存的NK细胞于冻存前先与L‑脯氨酸和β‑巯基乙醇混合培养，然后再与NK细胞冻存液混合，得到细胞悬液，将细胞悬液置于无菌冻存管中，于液氮中冻存。本发明创造性地发现在冻存前的NK细胞培养阶段向培养体系中添加L‑脯氨酸和β‑巯基乙醇，能够使冻存复苏后仍保持较高的细胞存活率和杀伤能力。这种方法提供了一种冻存剂配方改良以外的NK细胞保存策略，可以减少冻存剂中二甲基亚砜等细胞保护剂的用量，使冻存液对冻存细胞和人体的毒性大大降低，以及降低成本。
一种增加 nk 细胞复苏活性方法及其应用

[发明专利]一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用-CN202310061239.9在审
发明人： 王冶陶;彭昉;俞英豪 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2023-01-16 - 公布日： 2023-04-18 - 主分类号： C01B32/39 文献下载
摘要：本发明涉及一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。
一种 nk 细胞冻存液及其制备方法应用

[发明专利]一种组合物及其在扩增自然杀伤细胞中的应用-CN202310003802.7在审
发明人： 王冶陶;彭昉;俞英豪 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2023-01-03 - 公布日： 2023-03-31 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明公开了一种组合物及其在扩增自然杀伤细胞中的应用。所述组合物含有白介素21、白介素12A、白介素12B和CD80。本发明设计特定组分的组合物，利用白介素21、白介素12A、白介素12B和CD80协同配合，能够活化单核细胞中的多种免疫细胞，创造适合NK细胞生长的环境，有效激活扩增NK细胞，此外，配合白介素7和/或维生素C能够进一步促进NK细胞的激活和增殖，培养14天的扩增倍数高于3861倍，最高约6853倍，90％以上的淋巴细胞变成NK细胞。
一种组合及其扩增自然杀伤细胞中的应用

[发明专利]一种NK细胞的培养体系及培养方法-CN202011539113.0有效
发明人：俞英豪;彭昉;王冶陶 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2020-12-23 - 公布日： 2023-03-14 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞的培养体系及培养方法。本发明提供的培养体系包括组分1和组分2；组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；组分2为NK细胞无血清培养基。利用本发明培养体系对NK细胞进行培养、扩增，14天可获得90％以上的效应细胞，扩增倍数约11000倍，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。
一种 nk 细胞培养体系方法

[发明专利]基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用-CN202011538952.0有效
发明人：俞英豪;王冶陶;彭昉;蔡燕萍 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2020-12-23 - 公布日： 2022-09-09 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及基因工程细菌及其在淋巴细胞扩增中的应用。本发明利用异体原核生物作为滋养层细胞，通过基因工程手段获表达CD137L、IL21和CD4中至少一种蛋白的基因工程细菌，将该基因工程细菌表达用于扩增淋巴细胞，具有扩增效率高、安全性好的优点，且成本更低。实现结果表明，利用本发明基因工程细菌扩增纯化的NK细胞或未经纯化的淋巴细胞，NK细胞14天分别增长25892.99倍、30150.22倍。其中，对未经纯化的淋巴细胞进行培养，获得NK细胞的纯度达98.5％，显著优于传统因子培养以及现有滋养细胞技术的培养效果。
基因工程细菌及其淋巴细胞扩增中的应用

[发明专利]一种强杀伤性NK细胞的培养基及体外扩增方法-CN202210716228.5在审
发明人：俞英豪;王冶陶;彭昉;蔡燕萍 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2022-06-23 - 公布日： 2022-08-12 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明公开了一种强杀伤性NK细胞培养基。本发明公开了一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5‑15μg/mL抗Her‑2单克隆抗体、900‑1100U/mL重组人IL‑2、25‑35ng/mLIGF‑1等，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、900‑1100U/mL重组人IL‑2、25‑35ng/mL重组人IL‑15、5‑15ng/mL重组人IL‑21，继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
一种杀伤性 nk 细胞培养基体外扩增方法

[发明专利]一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法-CN202210716229.X在审
发明人：俞英豪;王冶陶;彭昉;叶志春 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2022-06-23 - 公布日： 2022-08-12 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明公开了一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，包括如下步骤：向GT‑T551基础培养基中加入IL‑2、IL‑12、IL‑15、IL‑17、黄芩素、姜黄素、云芝多糖，得到NK细胞培养基；NK细胞培养基中，IL‑2的浓度为500‑600μg/mL，黄芩素的浓度为10‑20μg/mL，姜黄素的浓度为10‑20μg/mL，云芝多糖的浓度为15‑25μg/mL；采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，每隔2天，补加含IL‑2的GT‑T551培养基，培养至第7天，扩瓶培养；培养至第14天，获得高纯度NK细胞。
一种纯度 nk 细胞体外扩增培养方法

[发明专利]一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法-CN202210681141.9在审
发明人：俞英豪;彭昉;王冶陶;洪茜茜;叶志春;蔡燕萍;王朝芳 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2022-06-16 - 公布日： 2022-08-09 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明公开了一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，向Cellgro基础培养基中加入OK‑432、IL‑2、IL‑15、IL‑21和复合中药提取物得到诱导培养基；向Cellgro基础培养基中加入rhGM‑CSF、rhIL‑4、复合中药提取物得到增殖培养基；无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，然后向其中加入Ficoll分离液，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；将所得外周血单个核细胞稀释，然后加入诱导培养基中重悬，加入anti‑CD137，培养2‑3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加IL‑2、IL‑15和IL‑21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
一种采用植物提取物体外诱导扩增 nk 细胞方法

[发明专利]一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法-CN202210682580.1在审
发明人：俞英豪;彭昉;王冶陶;洪茜茜;王朝芳 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2022-06-16 - 公布日： 2022-08-09 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明公开了一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：向GT‑T551H3培养液中添加自体血浆、150‑250IU/mLIL‑2、1‑5μg/mL紫草提取物得到培养基组A；向GT‑T551H3培养液中添加自体血浆、150‑250IU/mLIL‑2、10‑30ng/mLIL‑15、50‑100ng/mLIL‑21、1‑5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B；从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中培养3天，细胞浓度为2‑4×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
一种 nk 细胞纯度高效率扩增方法

[发明专利]一种采用K562细胞扩增NK细胞的方法-CN202210682587.3在审
发明人：俞英豪;彭昉;王冶陶;王朝芳;洪茜茜 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2022-06-16 - 公布日： 2022-08-09 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明公开了一种采用K562细胞扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：采用重组慢病毒对K562细胞进行感染，感染时间为10‑20h，通过流式细胞术和有限稀释法进行克隆得到工程细胞株；然后采用钴‑60辐照灭菌得到滋养细胞；采用外周血分离单个核细胞，然后加入至NK细胞完全培养基中重悬，加入滋养细胞混合均匀，置于37℃、二氧化碳浓度为2‑6％的培养箱中培养；培养至第3天时，离心弃掉上清液，加入相同体积的NK细胞完全培养基混合均匀，继续置于37℃、二氧化碳浓度为2‑6％的培养箱中培养；培养至第7天，补加1‑2μg/mLIFN‑γ和自体血浆；继续培养至第14天得到采用K562细胞扩增的NK细胞。
一种采用 k562 细胞扩增 nk 方法

[发明专利]一种人工抗原递呈细胞及其制备方法和应用-CN201911352762.7有效
发明人： 王冶陶;吴忠福;彭昉;俞英豪 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2019-12-25 - 公布日： 2022-05-10 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明提供了一种人工抗原递呈细胞及其制备方法和应用，所述人工抗原递呈细胞表达膜蛋白MICA、IL‑12和CD80，用于培养NK细胞或含有NK细胞的外周血单核细胞，可以显著提高NK细胞的数量，延长NK细胞的寿命，提高NK细胞的活性，与现有的表达MICA的人工抗原递呈细胞相比，具有更强的扩增激活NK细胞的效果。
一种人工抗原细胞及其制备方法应用

[发明专利]一种NK细胞的培养基及培养方法-CN202111572220.8在审
发明人：俞英豪;彭昉;王冶陶;蔡燕萍 -专利权人：杭州中赢生物医疗科技有限公司
申请日： 2021-12-21 - 公布日： 2022-03-18 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞的培养基及培养方法。采用本发明提供的培养基培养PBMC，获得的NK细胞(CD3‑CD56+)平均纯度达到80％以上，平均扩增倍数达4076倍(按照起始培养NK细胞占比PBMC7.5％计)，细胞杀伤活性(效靶比为20:1)5小时杀伤80％以上。
一种 nk 细胞培养基培养方法

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