本发明提供一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用。RcMYB3转录因子来源地黄近缘物种天目地黄，与拟南芥PAP2基因cDNA相似性51.09％，序列长度963bp，包含一个完整的开放阅读框，编码区长度795bp，推测编码264个氨基酸。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。对RcMYB3氨基酸序列的结构特征和进化特征进行分析，与已知花青素调控MYB转录因子的同源性均低于50％。RcMYB3基因可参与调控花青素的合成，利用转基因技术将RcMYB3转录因子过量表达载体转化地黄，可以有效提高地黄叶和块根的花青素含量。
本发明提供一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用，首次从天目地黄花冠中克隆得到一条正调控花青素的MYB转录因子RcMYB1的cDNA序列，推测获得了其编码的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在地黄中异源表达RgMYB1可明显地提高地黄叶、块根和花中的花青素含量，从而确定其参与正调控植物花青素合成的功能。
本发明涉及一种创制地黄杂合突变体的方法和应用，属于分子生物学技术领域，本发明所述的CRISPR/Cas9系统靶向地黄RgPDS1基因，RgPDS1基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶位点序列如SEQ ID NO.2所示，本发明根据靶序列合成一对互补的上下游引物；引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，进一步筛选出构建成功的重组质粒；将重组质粒转化根癌农杆菌，采用叶盘法遗传转化技术侵染地黄外植体并获得杂合突变体植株。首次实现了利用CRISPR/Cas9基因编辑体系在地黄中创制杂合突变体，为加速地黄分子育种进程，品种改良及种质资源的创新提供新的研究手段，还有利于进一步研究一些关键调控基因的功能。
本发明公开了一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用，具体包括基因RgWRKY37的克隆、含有该基因的植物表达载体构建，该基因对毛蕊花糖苷生物合成途径催化酶基因的调控作用，上述地黄RgWRKY37基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用转基因技术将地黄RgWRKY37过量表达载体转化地黄显著提高毛状根中毛蕊花糖苷的含量，本发明获得毛蕊花糖苷含量显著提高的转RgWRKY37基因的地黄毛状根，本发明中RgWRKY37基因可应用于地黄品质改良，提高地黄中毛蕊花糖苷的含量，对于毛蕊花糖苷的规模化生产提供高产、新型的优质原料，对于毛蕊花糖苷药源紧缺性问题的缓解有积极的促进意义和应用价值。
本发明公开了适用于天目地黄的qRT‑PCR内参基因及其应用。本发明基于天目地黄花的5个不同发育时期和叶转录组数据中筛选出6个表达量相对稳定的候选内参基因，并利用qRT‑PCR技术，通过GeNorm、NormFinder和Bestkeeper 3种不同算法对候选参考基因的稳定性进行分析。结果表明，针对天目地黄花和叶组织的最佳内参基因数目为两个，为RcTIP41和Rc18S；其中，RcTIP41基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Rc18S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明确定了天目地黄花和叶qRT‑PCR的最适内参基因，并提供了内参基因的特异性引物，为天目地黄中相关基因表达的精确定量分析提供了重要参考。
