本申请涉及一种高产丁二酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。所述重组大肠杆菌是通过将大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34得到,所述pJ23119和所述RBS34的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本申请采用CRISPR‑cas9基因编辑技术过量表达大肠杆菌iscS基因,通过将重组大肠杆菌中iscS的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34,更高表达强度的iscS能够促进硫化氢的产生,有助于维持大肠杆菌在厌氧条件下的细胞生长和存活,同时有利于丁二酸的积累。