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[发明专利]机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法-CN202210731755.3有效
发明人： 樊廷俊;赵君 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2022-06-26 - 公布日： 2023-07-25 - 主分类号： A61L27/36 文献下载
摘要：机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，包括利用已有的人角膜内皮种子细胞，以及机械强度增强后的去上皮层羊膜载体支架，通过添加专用培养体系，将人角膜内皮种子细胞悬液接种到机械增强型去上皮层羊膜载体支架上，即构建出机械性能、组织结构和功能与正常角膜内皮相近的组织工程角膜内皮。本发明攻克了传统组织工程角膜内皮机械性能不足无法应用于DMEK术式的难题，同时构建出的组织工程角膜内皮具有角膜内皮细胞密度极高、连接紧密的单层内皮结构（高达3500~3800个细胞/mm2，相当于0~3岁儿童的角膜内皮细胞密度），且移植到刮除角膜内皮的家猫及猕猴眼中可使动物角膜长期维持透明，重建出可以行使正常功能的角膜内皮。
机械增强组织工程角膜内皮体外构建方法

[发明专利]机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架制备方法及应用-CN202210731767.6有效
发明人： 樊廷俊;赵君 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2022-06-26 - 公布日： 2023-07-11 - 主分类号： A61L27/36 文献下载
摘要：机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架制备方法及应用。首先切取新鲜猪角膜后板层进行溶胀，再反复冻融利用角膜脱细胞专用溶液破碎细胞后，DNA‑RNA酶处理去除残留核酸物质，风干后浸入角膜专用交联剂溶液中进行交联，再次风干后使用电离射线进行辐照灭菌制成。所述载体支架应用于组织工程角膜内皮和角膜后板层生产，从而满足批量生产和临床应用对支架机械强度的要求。本发明适于规模化生产和临床推广应用，所制备的载体支架具有结构完整、机械强度更接近于天然角膜后板层、与人角膜内皮组织细胞有良好的生物相容性、可应用于DSAEK术式且其生产成本低等特点，满足组织工程角膜内皮和后板层生产所需大量且机械性能理想载体支架的要求。
机械增强细胞角膜后板层载体支架制备方法应用

[发明专利]角膜缘干细胞原代培养方法-CN201811178859.6有效
发明人：徐彬;樊廷俊;田成磊;郑明月 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2018-10-10 - 公布日： 2021-09-24 - 主分类号： C12N5/079 文献下载
摘要：本发明涉及一种角膜缘干细胞原代培养方法。其特征在于经庆大霉素溶液处理后的角膜缘组织剪碎后置于组织消化液中消化、过滤，并将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块（即滤渣）用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理生长至对数期的角膜缘成纤维细胞，制成角膜缘干细胞滋养层，最后复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养即得。该角膜缘干细胞安全性高、稳定性好，完好地满足了临床治疗的高要求。
角膜干细胞培养方法

[发明专利]一种组织工程后板层角膜的体外构建方法-CN201911333895.X在审
发明人： 樊廷俊;徐彬;赵君 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2019-12-23 - 公布日： 2020-05-08 - 主分类号： A61L27/38 文献下载
摘要：本发明涉及一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，与带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在其后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。本发明攻克了人角膜内皮细胞在体外无法增殖的国际难题，角膜内皮细胞形成密度极高、连接紧密的单层内皮结构高达3400‑3600个细胞/mm2；接种角膜基质细胞采用注射接种法，既大大缩短了体外培养时间，又能保持载体支架结构的完整性。因此可满足高质量需求和低成本实现批量生产而得以推广应用。
一种组织工程后板层角膜体外构建方法

[发明专利]一种完整肽链牛胶原蛋白的生产方法-CN201811316666.2在审
发明人：徐彬;樊廷俊;姜国建 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2018-11-07 - 公布日： 2019-02-26 - 主分类号： C07K14/78 文献下载
摘要：一种完整肽链牛胶原蛋白的生产方法。其特征是将牛跟腱预处理之后均在低温条件下进行操作：首先用非胶原蛋白去除液处理，后用胶原蛋白溶解液进行溶解，并进行充分匀浆后补加胶原蛋白溶解液继续溶解胶原蛋白，再添加胶原蛋白酶解液进行酶解，离心后收集上清液，之后加入胶原蛋白析出液使胶原蛋白析出，离心后收集沉淀，重复上述胶原蛋白溶解液溶解胶原蛋白‑离心收集上清液‑胶原蛋白析出液析出胶原蛋白‑离心收集沉淀‑胶原蛋白溶解液溶解‑离心收集上清液的处理步骤，最后将上清液进行透析，即得完整肽链牛胶原蛋白，冷冻干燥后保存。可作为医用生物材料应用于组织工程载体支架、手术缝合线、护创敷料等的制备。
胶原蛋白溶解液上清液溶解牛胶原肽链蛋白析出离心收集析出液胶原蛋白酶解液预处理敷料离心收集沉淀医用生物材料组织工程载体非胶原蛋白手术缝合线低温条件去除液补加跟腱护创酶解透析匀浆支架制备沉淀保存生产重复应用

[发明专利]角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法-CN201811178858.1在审
发明人：徐彬;樊廷俊;郑明月;田成磊 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2018-10-10 - 公布日： 2019-02-12 - 主分类号： C12N5/0797 文献下载
摘要：本发明涉及一种角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法。其特征是经庆大霉素溶液处理后的角膜缘组织剪切小块后置于组织消化液中消化、过滤、收集组织细胞沉淀，之后用角膜缘干细胞原代培养液重悬上述沉淀，接种于用角膜缘干细胞包被液预处理的细胞培养板进行原代培养，待出现细胞克隆球后，使用组织消化液对细胞克隆球进行消化，然后离心、收集细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养，即获得稳定的角膜缘干细胞。为获得更多稳定的角膜缘干细胞，在上述的继代培养之后还可进行多代扩增培养，获得稳定性好、安全性高、以满足临床上应用的大量干细胞。
角膜缘干细胞培养液预处理细胞克隆球细胞培养板继代培养体外培养消化液重悬沉淀接种庆大霉素溶液消化角膜缘组织扩增培养细胞沉淀原代培养组织细胞包被液干细胞剪切多代继代小块过滤细胞应用

[发明专利]一种组织工程人角膜基质的体外构建方法-CN201510039441.7有效
发明人： 樊廷俊;于苗苗;徐彬;庞鑫;苗莹 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2015-01-26 - 公布日： 2017-06-30 - 主分类号： A61L27/38 文献下载
摘要：本发明涉及一种组织工程人角膜基质的体外构建方法。其特征是用组织工程人角膜基质体外构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架专用复水溶液复水后的脱细胞猪角膜基质载体支架中，置入24孔培养板中，加入体外构建专用培养液A进行体外培养，期间更换体外构建专用培养液B继续培养，即得组织工程人角膜基质。本发明生产成本低、耗时少，更好的保持了载体支架结构的完整性，所构建出的组织工程人角膜基质在形态结构和透明度上与正常人角膜基质相似，并具有正常角膜基质的功能，可作为捐献角膜的替代物用于角膜基质异常的修复，因此已可用于批量生产满足对组织工程人角膜基质的高质量需求。
一种组织工程角膜基质体外构建方法

[发明专利]利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及应用-CN201410459064.8有效
发明人： 樊廷俊;于苗苗;徐彬;庞鑫;邱月 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2014-09-11 - 公布日： 2014-12-10 - 主分类号： A61L27/36 文献下载
摘要：一种利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及应用。首先切取新鲜猪角膜片进行溶胀，再反复冻融破碎细胞后，DNA-RNA酶处理去除残留核酸物质，然后交联、风干，最后电离射线进行辐照灭菌制成。本发明应用于组织工程角膜上皮、基质、内皮、前板层半角膜、后板层半角膜和全层角膜的载体支架，从而满足组织工程角膜批量生产的需要。用作人角膜基质的替代物而用于未累及全层的角膜溃疡的临床移植和治疗。本发明适于规模化生产和临床推广应用。所制备的角膜载体支架具有透明性好、结构致密、机械性强、与人角膜种子细胞生物相容性好等特点。因而适于批量生产，从而满足了组织工程角膜所用大量载体支架的需要。
利用新鲜角膜制备组织工程载体支架方法应用

[发明专利]一种人角膜基质细胞系的构建方法-CN201210163244.2有效
发明人： 樊廷俊;徐晓辉;赵君;苗莹;王宝泉;杜玉堂 -专利权人：中国海洋大学;青岛中皓生物工程限公司
申请日： 2012-05-24 - 公布日： 2012-10-03 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：一种人角膜基质细胞系的构建方法，具体涉及一种利用海水鱼类胶原蛋白制备组织工程人角膜基质载体支架的方法，是采用非酶解鳕鱼皮胶原蛋白冻干粉充分溶解于盐酸中，离心去除沉淀后将上清液分装入培养板孔中冻干，加入含硫酸软骨素的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联剂进行交联，用碱性Na2HPO4溶液稳定后，用2M NaCl、1M NaCl和蒸馏水清洗，冻干后完成制备。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可用于批量生产，满足组织工程人工角膜基质规模化重建对载体支架的大量需求，为人角膜基质病盲通过临床角膜移植和重见光明创造条件，且此载体支架制备以及应用于组织工程人工角膜基质体外重建和临床治疗的成本低。
一种角膜基质细胞系构建方法

[发明专利]一种组织工程人角膜上皮的重建方法-CN201110039099.2有效
发明人： 樊廷俊;徐彬;杨洪收;孙爱;王宝泉 -专利权人：中国海洋大学;青岛中皓生物工程有限公司
申请日： 2011-02-16 - 公布日： 2011-08-31 - 主分类号： A61L27/38 文献下载
摘要：本发明涉及一种组织工程人角膜上皮的重建方法，是利用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液将人角膜上皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA消化法获得完全去除上皮层的消化羊膜载体支架，平铺在插入式培养皿中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和10％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜上皮细胞，接种至平铺有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中采用气-液界面培养法进行组织工程人角膜上皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜上皮可用于批量生产，满足广大角膜上皮病盲患者临床角膜移植治疗对组织工程人角膜上皮的大量需求，且组织工程人角膜上皮体外重建和临床治疗的成本低。
一种组织工程角膜上皮重建方法

[发明专利]一种人角膜上皮细胞系的构建方法-CN201110039014.0有效
发明人： 樊廷俊;赵君;杨洪收;徐彬;孙爱 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2011-02-16 - 公布日： 2011-08-31 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本发明涉及一种人角膜上皮细胞系的构建方法，构建方法是先将角膜消毒，再将角膜消化后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的组织块后，将组织块向下平贴于培养孔的底部，然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间更换培养液，细胞长成单层后进行传代培养，现已传至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；其中，培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液，此外培养液还添加了0.08‰～0.1‰的IV型胶原。本发明的构建方法利用人角膜上皮组织成功建立了未经转染的人角膜上皮细胞系，建立的细胞系可以连续传代，能提供出大量的人角膜上皮细胞。
一种角膜上皮细胞系构建方法

[发明专利]利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法-CN201010102340.7有效
发明人： 樊廷俊;赵君;马西亚;丛日山;杨洪收;于昊泽 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2010-01-22 - 公布日： 2010-09-29 - 主分类号： A61L27/36 文献下载
摘要：本发明涉及一种利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法，采用1∶1000硫酸妥布霉素液对新鲜羊膜进行浸泡消毒，经胰蛋白酶-EDTA消化液倒置消化后，用细胞刮刀轻刮羊膜上皮面以全部去除残留上皮细胞，获得去上皮层羊膜，平铺在培养板孔中牢固干贴后，用去上皮层羊膜专用包被液进行包被处理，吸出包被液晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可批量生产，以满足组织工程人工角膜内皮规模化重建对载体支架的大量需求，为角膜内皮盲通过临床角膜移植而复明创造条件，且该载体支架制备方法应用于组织工程人工角膜内皮体外重建和临床治疗的成本低。
利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架方法

[发明专利]一种组织工程人角膜内皮的重建方法-CN200910020034.6有效
发明人： 樊廷俊;赵君;王晶;杨洪收;丛日山;于昊泽 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2009-03-23 - 公布日： 2009-08-19 - 主分类号： C12N5/08 文献下载
摘要：本发明涉及一种组织工程人角膜内皮的重建方法，是利用20％小牛血清-DMEM/F12培养液将角膜内皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶消化获得完全脱上皮层的羊膜载体支架，平铺在培养板孔中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和20％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜内皮细胞，接种至在平铺有羊膜载体支架的培养板孔中启动体外培养，进行组织工程人角膜内皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜内皮可用于批量生产，满足角膜内皮盲临床角膜移植治疗对组织工程人角膜内皮的大量需求，且组织工程人角膜内皮体外重建和临床治疗的成本低。
一种组织工程角膜内皮重建方法

[发明专利]一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法-CN200910020033.1无效
发明人： 樊廷俊;张亚南;徐彬;荆昭 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2009-03-23 - 公布日： 2009-08-19 - 主分类号： C07K14/805 文献下载
摘要：本发明涉及一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，首先用注射器插入新鲜毛蚶鳃部取血，离心收集血细胞沉淀，然后用Hepes缓冲液悬浮后，在-80℃和4℃反复冻融破碎细胞，离心收集上清液，4℃离心浓缩至0.5毫升，上样于Superdex200凝胶过滤柱，0.5毫升/分洗脱，1毫升/管收集洗脱组分，检测并收集具有波长415nm高吸收值的洗脱组分，4℃离心浓缩至0.5毫升，继续上样于SephacrylS-100凝胶过滤柱，0.5毫升/分洗脱，1毫升/管收集洗脱组分，最后检测并收集具有波长415nm最高吸收值的洗脱组分，即为毛蚶血红蛋白纯化样品。本发明方法简便、重复性好且血红蛋白的得率高，所纯化血红蛋白仍保持有四级结构和天然活性，便于进行多重生物学功能研究。
一种毛蚶分离纯化血红蛋白方法

[发明专利]褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法-CN200810249565.8无效
发明人： 樊廷俊;魏云波;姜国建 -专利权人：中国海洋大学
申请日： 2008-12-26 - 公布日： 2009-06-10 - 主分类号： C12N5/06 文献下载
摘要：本发明涉及一种褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼心脏组织为材料，采用胰蛋白酶消化法启动原代培养，在含胎牛血清、碱性成纤维样细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、硫酸软骨素和对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼心脏细胞系，目前已传至第70代，其工艺科学合理，可望应用于鱼类病毒的分离、繁殖、病毒疫苗制备，以及病毒与宿主细胞相互作用等方面研究；还可作为环境毒理学研究环境污染物的模型，对海洋中存在的各种环境污染物，包括基因毒物、诱变剂、致癌物、环境激素和内分泌干扰物等，进行污染监测和安全性评价。
石斑鱼心脏细胞系构建方法

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