本发明公开了一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的特异性引物,包括CO5S/5A和TR11S/11A,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~4所示。还公开了一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的试剂盒,包括上述特异性引物。还公开了一种快速检测鸡球虫与组织滴虫的双重PCR方法:提取待检测样品的DNA;以DNA为模板,利用上述特异性引物或试剂盒进行PCR扩增,得扩增产物;扩增产物进行凝胶电泳,依据凝胶电泳结果进行判断:若同时扩增出428bp和176bp的产物,则该样品为球虫和组织滴虫阳性;若单独扩增出428bp的产物,则该样品为球虫阳性;若单独扩增出176bp的产物,则该样品为组织滴虫阳性。本发明的能够快速准确的对鸡球虫和组织滴虫进行检出,可最低检测到0.026ng球虫DNA和0.35ng组织滴虫DNA,敏感性高。