本发明提供一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法和应用,具体提供了一种重组火鸡疱疹病毒,在火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区中插入外源基因,所述外源基因选自来自鸡新城疫病毒、禽流感病毒或禽传染性囊病病毒的基因;所述火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区为火鸡疱疹基因组的8867nt‑9319nt之间,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明首次发现HVT005‑HVT006间隔区可作HVT外源基因插入的位点。利用CRISPR/Cas9技术在HVT基因组HVT005‑HVT006间隔区插入外源基因,可作为鸡新城疫预防和禽流感预防的疫苗候选株。