本发明公开了一种RAA‑LFD检测鸡马立克病毒野毒株和SC9‑1疫苗株的引物和探针组合及其应用,包括:引物探针组合A和引物探针组合B;所述引物探针组合A中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示;所述引物探针组合B中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.6所示。本发明使用不同荧光标记MDV野毒株和SC9‑1疫苗株的探针,从而实现了短时间内同时检测鸡体内疫苗毒和野毒的存在情况,检测的灵敏度可达10copies/μL;检测的重复性好、准确度高,为MDV在鸡群中的净化提供了技术支持。