[发明专利]生产等电点高于8或低于5的多肽的方法

说明书

本发明涉及用于肽生产的方法和试剂。本发明特别涉及生产等电点高于8或低于5多肽的方法。本发明的一种优选的实施例涉及b-型钠尿肽的生产。

本发明针对表达和回收一种肽的有效方法，特别是需要生产具有高等电点或低等电点的肽时，从而使离子交换层析法作为肽纯化的一个步骤成为必须的。本发明虽然以具有相对高的等电点的b-型钠尿肽为例作为说明，但是本领域的技术人员将可以应用本发明所公开的方法和试剂来生产其它具有高等电点或低等电点的肽。

本领域众所周知，在一个重组宿主细胞中，例如大肠杆菌，用表达编码肽的DNA来生产长度少于50个氨基酸的肽会遇到所表达的肽在宿主细胞内发生酶降解的问题，导致部分甚至全部的肽的破坏。解决此问题的最普通的方法是设法使肽在宿主细胞中不溶解。有效的方法是肽表达为一种融合蛋白，在该融合蛋白中肽被连接在一个融合配偶体上。通常，该融合配偶体会与肽的N-端融合。该融合蛋白在细胞内形成包含体，在包含体中，肽受到保护，免受蛋白水解酶的降解作用。

在该包含体从宿主细胞回收后，必须将该肽从前导序列中分离、纯化并以活性形式回收。从前导序列中分离可通过在前导序列和肽之间的连接处放置一种氨基酸序列来进行，可以被特异性地识别，并在合适的条件下分离，如酸分离或酶分离。由于酶的高成本以及可用的时效受限，酶分离的方法往往不可能在商业规模的生产上实现，即使在一个固定的分离柱中使用也难以实现。

可以在前导序列和肽的连接处放置一种特定的二肽，以实现酸裂解，这种二肽的第一个氨基酸是天冬氨酸。第二个氨基酸的确定将决定了在酸性条件下该二肽键裂解的速率。当然，如果所需生产的肽中有任何可被酸裂解的二肽序列，即么在该前导序列和肽接合处的裂解点的酸裂解速率必须比肽内部的裂解速率高得多，以避免产量的较大损失。可进行酸裂解的二肽的相对反应速率如下：

    二肽    相对反应速率Asp-Pro^*    10x Asp-X X=Gly^*,Ser^*,Leu^*,Ile,Val    1x Asp-Lys^*    0.5x Asp-Arg^**    0.2x^*F.Marcus,Intl.J.Peptide and Protein Res.(1985)25:542-546^**本发明的观察

在用酶或酸裂解之前，通常用一种离液剂处理包含体中的融合蛋白，使其溶解，离液剂会引起蛋白结构的伸展。然后将该溶解了的融合蛋白裂解，所需的肽被分离并纯化，然后对该肽加以使其再折叠成一种有生物学活性的构象的条件，例如，在需要形成蛋白内的二硫键时去除离液剂和氧化。

通常所说的b-型钠尿肽或BNP在人体中以一种32-氨基酸的肽出现，这种物质在体内是通过一种134-氨基酸的前体蛋白的裂解而产生的。编码该人类b-型钠尿肽前体蛋白的DNA序列已被分离出(US Patent No5114923)。经人体临床实验证明，b-型钠尿肽可在无直接心脏刺激(这可以引起有害的副作用，如心律不齐等)的情况下改善心功能，降低某些可引起增加死亡率的神经激素水平并促使改善心力衰竭。因此，b-型钠尿肽可用于治疗充血性心力衰竭患者。