[发明专利]生产等电点高于8或低于5的多肽的方法

权利要求书

1．一种生产等电点高于8或低于5的纯化的多肽的方法，包括：

(A)在一种重组宿主细胞中以一种融合蛋白的形式表达所述的肽，其中，所需的肽在其N-末端与一种融合配偶体融合，该融合配偶体在其C-末端包括具有Asp残基的氨基酸序列，其中(Ⅰ)该融合配偶体的C端Asp残基和该肽的N端残基形成一个在酸性条件下可断裂的键；(Ⅱ)该肽与融合配偶体、任何经酸裂解融合配偶体所产生的不需要的片段之间具有足够的净电荷差别，使该肽能够通过离子交换层析从融合配偶体和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分离出来；(Ⅲ)该融合蛋白在重组宿主细胞中形成包含体；

(B)从重组宿主细胞中回收包含体；

(C)在无离液剂情况下将融合蛋白置于酸性条件，将肽与融合配偶体之间进行裂解；

(D)用一种非离子型的离液剂对不溶性的裂解产物进行溶解化处理，所使用的条件是使其变得可溶但又不破坏肽的一级结构；

(E)用离子交换层析分离肽。

2．权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白的PI在6.0-8.0之间。

3．权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白的PI在6.5-7.5之间。

4．权利要求1所述的方法，还包括将分离的肽置于使其重新折叠成具有生物活性的三级结构，并形成生物学活性所需的分子内二硫键的条件下的步骤。

5．权利要求1所述的方法，其中所需的肽内部不含有在酸性条件下可裂解的二肽序列。

6．权利要求1所述的方法，其中所述的肽内部含有一个或多个在酸性条件下可裂解的二肽，其裂解速率低于融合配偶体的C端残基和肽的N端氨基酸残基形成的二肽的裂解速率。

7．权利要求1所述的方法，其中所述的肽是b-型钠尿肽。

8．权利要求1所述的方法，其中在步骤(D)中所使用的非离子型的离液剂是尿素。

9．权利要求7所述的方法，其中，将肽用浓度为约3M至约7M的尿素处理。

10．权利要求1所述的方法，其中所述的肽在其具有生物学活性的构象时含有至少一个半胱氨酸残基间的二硫键，并且步骤(F)是在导致二硫键形成的氧化条件下进行的。

11．权利要求9所述的方法，其中所述的肽是b-型钠尿肽。

12．一种生产等电点高于8或低于5的纯化的多肽的方法，包括：

(A)在一种重组宿主细胞中以一种融合蛋白的形式表达所述的肽，其中，所需的肽在其N-末端与一种融合配偶体融合，该融合配偶体在其C-末端包括具有Asp残基的氨基酸序列，其中(Ⅰ)该融合配偶体的C端Asp残基和该肽的N端残基形成一个在酸性条件下可断裂的键；(Ⅱ)该肽与融合配偶体、任何经酸裂解融合配偶体所产生的不需要的片段之间具有足够的净电荷差别，使该肽能够通过离子交换层析从融合配偶体和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分离出来；(Ⅲ)该融合蛋白在重组宿主细胞中形成包含体；

(B)从重组宿主细胞中回收包含体；

(C)在无离液剂情况下将融合蛋白置于酸性条件，将肽与融合配偶体之间进行裂解；

(D)用超滤、渗滤或离心方法从该裂解混合物中去除不溶性的裂解产物；

(E)用离子交换层析分离肽。

13．权利要求1所述的方法，其中所述的肽在进行步骤(F)之后还进行一个或几个其它的纯化步骤。

14．权利要求13所述的方法，其中所述的肽是b-型钠尿肽，并在进行步骤(F)之后依次进行反相HPLC层析和额外的离子交换层析。