[发明专利]微生物脂肪酶酶法合成酯的方法

说明书

本发明涉及生物化工，具体的说是一种用微生物脂肪酶在有机溶剂中转化脂肪酸酯的方法。酯类物质是酿酒、食品、饮料、医药、日用化工等许多工业常用的化学物质。但是长期以来工业上是通过化学方法进行生产。即用无机催化剂(如浓硫酸等)在高温下催化醇酸酯化反应完成。化学方法生产有如下缺点：第一、使用的无机催化剂易带入铅、砷等重金属，在高温下化学催化会发生一些副反应而产生对人体有害的物质，尽管目前标有“食品级”的字样，但安全性不够高；第二、高温条件下反应生产中耗能高；第三、化学方法生产产品的档次低，在某些产品的使用中效果也差。例如，在大曲酒的调香中会产生不同于大曲酒自然香味的异香或浮香味，影响产品的质量。第四、从环境保护的角度来讲，目前应用生物技术替代化学途径转化生产化合物符合国际上发展潮流。尽管也有通过生物催化剂转化酯类物质的研究报道，如微生物直接发酵生产，但产物浓度低，无法进行经济规模的生产，微生物代谢产物的复杂性也影响了使用的范围。酶法转化目前则由于酶的催化合成能力低和稳定性不高，加上反应产物的浓度低等原因，只停留在研究阶段。

因此本发明的目的是为了解决上述方法的不足，采用微生物发酵产生的脂肪酶取代无机催化剂，利用酶在有机溶剂中生物催化酯化反应，在避免无机催化剂对人体造成的伤害，降低能耗，提高产品的使用效果，改善环境的同时，选用合成能力高的华根霉脂肪酶，采用表面活性剂非共价修饰脂肪酶来提高脂肪酶在有机溶剂中催化能力的稳定性。

本发明的主要技术内容如下：

a、加料：将底物醇酸按一定的等摩尔浓度(0.25～0.80mol/L)加入含有有机溶剂的常规酶反应器中搅拌溶解后，再加入6000～10000u/L的脂肪酶后开始反应。在脂肪酶加入反应系统之前，先将脂肪酶加入含有0.1％表面活性剂的有机溶剂中搅拌3小时后，过滤出脂肪酶用于上述反应系统。

b、反应：在30℃±10℃反应温度条件下，搅拌反应10-36小时，底物的摩尔转化率可达90-98％。

c、分离：反应结束后，由于脂肪酶不溶于有机溶剂，用过滤方法分离出脂肪酶，用有机溶剂洗涤后可以再次使用。分离出的反应液进行步骤四。

d、蒸馏：在减压蒸馏-0.05～0.08MPa的条件下，蒸发出反应媒体有机溶剂，得到产物酯。蒸发出来的有机溶剂经过冷凝、冷却和除水处理后可回收复用。整个过程基本上无废物排出。该发明是在有机溶剂中完成的酯化反应方程式为：

R-OH：脂肪醇    R’COOH：脂肪酸    R’COOR：脂肪酸酯其中mol/L：摩尔/升，u/L：单位/升，MPa：兆帕。整个反应工艺流程如下：

本发明采用本研究室筛选的华根霉(Rhizopus chinesis)生产的脂肪酶为酯化反应的催化剂。粗酶粉的酶活为360IU/g。Lypozyme IM脂肪酶(固定化Mucor miehei，Novo Nordisk公司)和Novozyme 435脂肪酶(固定化Candida antarctica，Novo Nordisk公司)在底物醇酸的浓度小于0.3mol/L时，效果也不错。其它市售的微生物脂肪酶的效果则较差。

IU的定义为：37℃条件下，pH为7.0的磷酸缓冲液中水解橄榄油，每分钟释放出1ug分子脂肪酸的酶量。

非共价修饰用的表面活性剂中效果较好的有：1)气溶胶硫代琥珀酸2-(2-乙己酸)酯钠盐(AOT)；2)十二烷基磺酸钠(LAS)；3)聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。表面活性剂的浓度高于或低于0.1％则都会影响脂肪酶的催化能力。

脂肪酸为3C～18C的饱和一元酸，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸：不饱和酸：18C的油酸。

脂肪醇为2C～18C的伯醇，如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇和油醇；4C～5C的仲醇，如异丁醇和异戊醇。

有机溶剂为Log P 3.5～4.0的有机溶剂，如己烷(Log P 3.5)、庚烷(Log P 4.0)。

反应温度：15～40℃。其中28℃最适，低于15℃或高于40℃，转化率都会有所降低。

脂肪醇酸的浓度比为3∶1到1∶1转化率都比较好。