[发明专利]高分子量的木霉纤维素酶

说明书

发明背景

1．发明领域

本发明涉及经纯化的或经分离的相应于来自木霉属的菌的EGⅥ的纤维素酶。本发明进一步涉及分离纯化的获自木霉属的菌或经遗传改造的木霉属的菌之EGⅥ纤维素酶的方法，涉及利用该纤维素酶用于去污剂、纺织品处理、提高动物饲料的价值、处理纸浆和纸、谷物湿磨等的方法和其它本领域熟知的利用纤维素酶的方法。

2．现有技术

纤维素酶是能够水解纤维素中β-D-葡萄糖苷键的酶。纤维素水解酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶(Knowles,J．等(1987),TIBTECH 5,255-261)；并已知由大量细菌、酵母和真菌产生。

有关纤维素水解酶的应用首先是那些涉及分解木材纤维素浆成为糖用于(生物)乙醇生产、纺织品处理如“石洗”和“生物上光”，以及在去污剂组合物中的应用。因此，已知纤维素酶可用于在机械纸浆处理(参考如PCT公开文本WO92/16687)。另外，已知纤维素酶还可用作饲料添加剂(参考如PCT公开文本WO91/04673)和用于谷物湿磨中。

然而最重要的是纤维素酶用于纺织品处理，即用于去污剂组合物中以帮助去除灰尘或灰球(grayish cast)(参考如英国申请号2,075,028、2,095,275和2,094,826，说明去污剂组合物结合纤维素酶后提高了清洁效果)或者在售前对纺织品进行处理，即改善纺织品的手感和外观。所以，英国申请号1,358,599说明纤维素酶在减小含棉织物的粗糙度的去污剂中的应用，并且纤维素酶用于纺织品处理，通过使其颜色更鲜艳而翻新旧织物(参考如The Shizuoka PrefecturalHammamatsu纺织品工业研究所报告第24卷第54-61页(1986))。例如，反复洗涤含棉织物导致织物灰球，相信这是由于纤维分裂和混乱所致，有时称作“纤维绒球”，是由机械作用引起。这种灰球在彩色织物上特别明显。因此，纤维素酶去除混乱的纤维上层而改善织物整体外观的能力非常有用。

因为纤维素是在真菌、细菌等中产生(表达)的，所以由某种真菌，尤其是由木霉属的菌(特别是长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum))产生的纤维素酶，已经引起关注，因为通过发酵过程可以容易地大量生产能够降解结晶形式纤维素的完整的纤维素酶系统。

Wood等在《酶学方法》(Methods in Enzymology),160,25,234页(1986)中公开了完整的真菌纤维素酶系统包括几个不同的酶种类，包括那些被鉴定为外切纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)，内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(＂EG″)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)(＂BG″)的酶。CBH、EG和BG真菌纤维素酶分类可进一步扩展到包括每种类型之中的多重成分。已从多种真菌资源中分离到CBH和EG。美国专利号5,475,101(Ward等)公开了从长枝木霉中纯化并分子克隆了EGⅢ。PCT公开文本第94/28117号公开了被称为EGV的来自Trichoderma reesei的20-25KD的纤维素酶。

尽管在本领域已知涉及具备一些或所有上述特性的许多纤维素酶组合物，但仍然需求具有不同特性的新的纤维素酶，以用于，例如，处理纺织品、作为去污剂组合物的一个成分、用于处理纸浆和纸以及用于生物量转化。申请人发现了从长枝木霉发酵液中分离到的一种新的纤维素酶，该酶在此前为本领域所未知。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种具有新特性的新的纤维素酶，该酶可用于利用纤维素酶的工业过程，例如去污剂、纺织品处理、作为一种动物饲料添加剂、谷物湿磨及纸浆和纸的处理。

根据本发明，提供一种纯化的新纤维素酶组合物，它基本上相应于此处所述的EGⅥ。EGⅥ可从长枝木霉发酵液中分离到，在SDS-PAGE上其分子量约为95-105kD(见图1)，在IEF胶上测得其等电点约为5.6-6.8,65℃时测得其对RBB-CMC的最适pH约为5.0，在40℃和50℃时pH为4或更低。

根据本发明的一个实施方案，提供一种从木霉发酵液中纯化或分离一种相应于EGⅥ的纤维素酶。优选地，该发酵液包括长枝木霉。更优选地，长枝木霉属的菌株已根据例如美国专利第5,328,841的方法经过遗传改造以删除纤维素酶CBHⅠ、CBHⅡ、EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ和EGⅤ。