[发明专利]重组人肝细胞生成素的生产方法及其治疗严重肝病的用途

说明书

本发明涉及一种生物工程产品的生产方法及用途领域，更具体地说为一种重组人肝细胞生成素(rHPO)的生产方法及产品在临床上的治疗作用。

肝脏是机体具有强大再生能力的脏器，有关其调控机理的研究国际上已进行百余年，但目前已知的肝再生相关生长因子如肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子-α(TGF-α)等，其作用均缺乏肝特异性，难以解释具有器官特异性的肝再生调控机理，因此，寻找新型肝再生调控因子一直是该领域的热点。1975年，LaBrecque等首先报道大鼠再生肝组织中含有一种具热稳定性的促肝增殖因子。80年代中期，我们在人胎肝组织中也发现同类因子，并对其生物活性、理化性质、蛋白质纯化及临床应用进行了系统研究。由于此类因子应用临床治疗严重肝病取得较好疗效，因而倍受重视，国内外多家实验室一直致力于此类因子的分子克隆。1995年，我们利用功能筛选法从人胎肝cDNA文库中分离到人肝细胞生长素cDNA，完成其核苷酸序列测定并通过构建真核、原核表达质粒，对其生物学活性进行了研究，证实该基因表达产物在体内能刺激肝细胞增殖，并于1996年3月申请中国发明专利，申请号为96103203.0。但至今尚未见国内外有关人肝细胞生成素高效表达及获取重组人肝细胞生成素的系统工艺报道。近年，国内在临床上应用从乳猪肝、新生小牛肝提取的促肝细胞增殖活性因子治疗严重肝病，取得满意疗效，但受材料来源、产品纯度、种族差异等限制，其应用受到较大限制。重组人肝细胞生成素的生产克服了这些限制，有望为临床提供有效的治疗严重肝病的药物。

本发明的目的是通过原核表达、纯化获取具有生物活性的重组人肝细胞生成素及用于临床上治疗严重肝病。

本发明其主要内容是在获取人肝细胞生成素cDNA并成功构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺，以获得重组人肝细胞生成素纯品，并对重组人肝细胞生成素的生物学性能进行了描述，表明重组人肝细胞生成素有在临床上治疗严重肝病的用途。

本发明在自行克隆人肝细胞生成素cDNA并成功构建高效表达菌株的基础上；建立并优化了一整套工程菌发酵、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺，其特征为：1)对工程菌低密度发酵，其最佳诱导表达时间为细胞密度OD₆₀₀＝0.3-0.4；2)包涵体变性剂是8M尿素或用0.05mol/L NH₄AC缓冲液配制的含1％巯基乙醇的7mol/L盐酸胍；3)采用复性溶液(2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)或稀释复性溶液(100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)进行复性；4)柱层析纯化可采用复性蛋白的柱层析纯化或包涵体在变性条件下进行柱层析纯化，其流程如图3；其中sp-FF柱上样后乙酸钠缓冲液洗脱未结合相、用300mmol/LNacl阶段洗脱rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)阴离子交换柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗脱未结合相。用350mmol/L NaCl阶段洗脱，rHPO在第一峰；5)柱层析纯化可采用包涵体在变性条件下进行柱层析纯化，其流程如图4；其中AcA44凝胶过滤柱层析上样后用2mol/L盐酸胍洗脱，rHPO在第二峰中；MONO Q离子交换层析上样后用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH₄Ac配制)将rHPO洗脱下来，rHPO在主峰中；通过该方法获得人肝细胞生成素纯品，纯度达99％，其N-端氨基酸序列(图2)测定与依据核苷酸序列推导的氨基酸序列(图1)一致；人肝细胞生成素等电点为7.2，分子量为15280道尔顿；在体外能促进原代培养肝细胞及肝癌细胞的增殖，在体内能促进CCL₄致损肝细胞DNA合成，并能显著提高CCL₄诱导肝功能衰竭大鼠存活率，因而提示重组人肝细胞生成素能应用临床治疗严重肝病。

结合附图说明本发明的具体实施方法如下：

图1为依据核苷酸序列推导的rHPO氨基酸序列

图2为测定的人rHPO N-端氨基酸序列

图3为本发明的工艺流程图

图4为本发明实施例二的工艺流程

图5为工程菌诱导表达水平的SDS-PAGE检测结果

图6为rHPO纯化产物SDS-PAGE结果