[发明专利]用超滤法从发酵液中分离棒酸

说明书

技术领域

本发明涉及棒酸以及棒酸的药学上可接受的盐和酯的纯化和/或制备方法，特别是碱金属盐(尤其是棒酸钾)，但不仅限于此。

背景技术

棒酸是(2R，5R，Z)-30(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸的常用名。棒酸及其碱金属盐和酯能有效地作为由一些革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物所产生的β-内酰胺酶的抑制剂。除了抑制β-内酰胺酶以外，棒酸及其碱金属盐还与青霉素和头孢菌素类抗生素有协同作用。棒酸及其盐被用于药物制剂，以防止β-内酰胺抗生素的失活。商业上的制剂包括棒酸钾和三水合羟氨苄青霉素的复方。棒酸钾比游离酸或其它盐更稳定。

棒酸通过微生物的发酵来制备，这些微生物如链霉菌属的菌株，例如带小棒链霉菌(S.clavuligerus)NRRL 3585、S.jumonjinensis NRRL 5741和桂滨链霉菌(S.katsurahamanus)IFO 13716和Streptomyces sp.P6621 FERM P2804。如GB1508977中揭示，将发酵后得到的含水培养物根据常规的方法(如过滤和色谱纯化)进行纯化和浓缩，然后用有机溶剂对水溶液进行萃取，得到不纯的棒酸溶于溶剂的溶液。

GB1508977揭示了通过使发酵液流经阴离子交换树脂来进行过滤，得到棒酸盐的制备方法。这一方法可以得到可接受的产率，但是它需要使用复杂的色谱纯化方法，而且从商业角度考虑，使用树脂柱占了生产投资的重要部分。

GB1543563中揭示了一种发酵方法，其中培养基的pH值保持在6.3至6.7的范围内。通过由棒酸锂的再盐化(re-salting)来制备药学上可接受的盐，如棒酸钾。

EP-A-0026044中揭示了使用棒酸的叔丁胺盐作为中间体来纯化棒酸。BE-862211或DE2733230说明了所述的盐，据述该盐比棒酸的钠盐或钾盐更稳定。叔丁胺是一种有毒的化合物，而且很难将其从废水中除去，这导致了严重的污染问题。

EP-A-0562583揭示了使用棒酸和N，N′-单取代的对称1，2-乙二胺的盐(如二棒酸N，N′-二异丙基乙二铵)作为有用的中间体来从乙酸乙酯的萃取液中分离和制备纯的棒酸或棒酸的碱金属盐。

通常经过滤的含棒酸的发酵液含有10-20％的蛋白质，以棒酸的量计。这些蛋白质阻碍了接下去的棒酸的分离和纯化。用离子交换树脂或絮凝剂来处理经过滤的发酵液是耗时和昂贵的，并且会增加不稳定的产物的降解。

发明内容

根据本发明，棒酸或其药学上可接受的盐或酯的制备和/或纯化方法，包括以下步骤：

用微量过滤法(microfiltration)从含棒酸的发酵液中除去固体，形成第一滤液，

用超滤法从第一滤液中进一步除去固体，形成第二滤液，

通过除去水来浓缩第二滤液，

处理经浓缩的第二滤液来分离棒酸或其药学上可接受的盐或酯，

其特征在于用超滤膜过滤第一滤液，所述超滤膜的分子量截留值(molecularweight cut-off)为10至30千道尔顿(kD)，渗透液(permeate)的流量为10至30升/(米²·小时)(1m^-2h^-1)。

使用本发明的超滤法，可以得到足够纯净的棒酸溶液，而不需要在转化成棒酸钾前形成中间体胺或二铵盐。较好的是，超滤是连续的，超滤膜包括聚砜。而且，第二滤液可以用反渗透进行浓缩，而不会将反渗透膜表面弄脏，或在其表面上形成不需要的凝胶层。可以提高流经反渗透装置的流量，而不需要经常性的清洗。

已发现，使用本发明能提高分离棒酸的效率，它的另一个优点是第二滤液经过超滤步骤后，基本上脱色了。

具体实施方式

发酵液的微量过滤法可以按我们的专利申请WO95/23870中所揭示的进行。根据所揭示的内容，较好的方法是将含有粗棒酸、菌丝体、蛋白质以及其它悬浮的固体物质的含水发酵液通过在pH为5.8至6.2之间，在约20至40℃的温度下进行微量过滤来纯化。