[发明专利]产生和纯化并测定具有HCVNS3蛋白酶蛋白水解活性的多肽的方法

权利要求书

1.分离的多肽，其特征在于它们由选自下组的氨基酸序列组成，这些氨基酸序列包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4和SEQ ID NO：5，并且其特征还在于它们具有HCV病毒NS3蛋白质的蛋白水解活性。

2.用于在宿主细胞中产生按照权利要求1的一种多肽的表达载体，这种表达载体包含：

-编码一种所说的多肽的多核苷酸；

-在所说的宿主有机体中可操作地与所说的多核苷酸结合的功能性调节、转录以及翻译序列；和

-可有可无的选择性标记。

3.使用按照权利要求2的表达载体转化的真核或原核宿主细胞，这种细胞能够表达由所选择的多核苷酸序列编码的特定多肽。

4.一种制备按照权利要求1的一种多肽的方法，其特征在于其包括下列操作(这些操作作为一个整体)：

-使用含有DNA序列的表达载体转化真核或者原核宿主细胞，所说的DNA序列编码选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的多肽；

-表达所需要的DNA序列以便产生所选择的多肽；和

-纯化如此获得的多肽，避免其重新溶解。

5.多肽，其特征在于它们由选自SEQ ID NOS：7-12、14、18-20、29-32、35和47所示的序列的氨基酸序列组成，其特征还在于它们在具有HCV NS3蛋白水解活性的多肽的体外活性的高流通量测定中可以用作为底物。

6.Depsipeptides，其特征在于它们由选自SEQ ID NOS：42-46所示的序列的氨基酸序列组成，其特征还在于它们在具有HCV NS3蛋白水解活性的多肽的体外活性的高流通量测定中可以用作为底物。

7.一种用于再现和有效地测定体外HCV NS3蛋白质的蛋白水解活性的方法，其特征在于在20和25℃之间的温度下，在含有30-70mM Tris pH6.5-8.5、3-30mM二硫苏糖醇、0.5-3％3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸和30-70％甘油的溶液中使用权利要求5的肽或权利要求6的depsipeptides作为底物，在高流通量测定中再现和试验按照权利要求1的多肽的活性。

8.按照权利要求7的用于体外再现和有效测定HCV NS3的蛋白水解活性的方法，其中在高流通量测定中，在按照权利要求1的多肽浓度在100和200 nM之间时使用权利要求5的多肽。

9.按照权利要求7的用于体外再现和有效地测定HCV NS3的蛋白水解活性的方法，其中在高流通量测定中，在按照权利要求1的多肽浓度在0.5和2nM之间时使用权利要求6的depsipeptides。

10.按照权利要求9的用于体外再现和有效地测定HCV NS3的蛋白水解活性的方法，其中通过使用选自SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示的序列的depsipeptides作为底物对权利要求1的多肽的蛋白水解活性进行连续的监测，所说的底物在荧光供体5-[(2’-氨乙基)氨基]萘-磺酸(EDANS)(靠近depsipeptide的一端)和受体基团4-[[4′-二甲氨苯基]偶氮]苯甲酸(DABCYL)(靠近depsipeptide的另一端)之间通过“共振能转移”具有内部荧光淬火。