[发明专利]防止血小板生成素(TPO)吸附的方法及含TPO的稳定组合物

说明书

                       发明背景

1.发明领域

本发明涉及一种稳定组合物，该组合物包含不具有糖链部分的TPO蛋白，更具体地说，本发明涉及含TPO的稳定组合物，该组合物可有效地防止作为活性成分的TPO的损失或滴度降低，所述损失或滴定降低是由于容器壁的吸附或TPO间的缔合或聚合等引起的。本发明还涉及防止由容器壁吸附所引起的TPO滴度减少的方法，所述容器装有本发明的组合物。

2.相关技术的公开

人类TPO(血小板生成素)是作为细胞因子受体超家族的成员之一Mpl的配体而被克隆的一种蛋白(de Sauvage等，自然(伦敦)，369卷，533-565(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，77卷，1117-1124(1994))。在患有血小板减少症的动物(如人，鼠，狗等)的血清和血浆中可检测到Mpl配体，已经证实该配体与巨核细胞和血小板的生成有关。

为了开发一种用于治疗血小板减少症的药剂，本发明人通过测定其刺激大鼠骨髓中高度纯化的巨核细胞祖细胞生成巨核细胞的活力，从患有血小板减少症的大鼠的血浆中提纯了大鼠TPO，并且成功地克隆了大鼠TPO的cDNA及基于部分氨基酸序列的人类TPO的cDNA，通过重组DNA技术获得了大量的同源人类TPO(H.Miyazaki等，实验血液学，22卷，838(1994))。这样获得的人类TPO的氨基酸序列与上面所提到的以人类Mpl配体得到的因子的序列一致(参见后文描述的SEQ ID NO：1)。

本发明人发现本发明的TPO对治疗血小板减少症是有效的，因为当将人类TPO施用给患血小板减少症的小鼠时，观察到抑制血小板减少的效果，增强血小板生成的效果和增加的造血功能，所述小鼠发生骨髓抑制，该抑制是由施用制癌剂或免疫抑制剂或放射线或BMT诱导的。

因为TPO的活性高，所以它可以极小量地应用，即它作为活性成分通常每天施用几次，剂量为0.05μg/kg体重-1mg/kg体重，优选0.5μg/kg体重-50μg/kg体重，依病情、性别和施用途径而不同。因此，有必要用极小量的TPO制备包含TPO的药物制剂，但是在这种情况下不可避免地出现因容器(例如小瓶、安瓿等)的吸附而引起TPO的滴度下降，以及滴注时制剂与输注液混合后TPO成分吸附于输注装置(瓶或管)而引起损失。

在这种情况下，本发明人研制了一种不含TPO的稳定组合物，它可防止具有糖链部分的TPO蛋白的吸附，当制备TPO药物制剂或当它与输注液混合时，可达到防止TPO滴度降低的目的。结果，现在已发现给TPO蛋白添加药用蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖表面活性剂，聚乙烯醇，聚乙二醇或氨基乙酸(又名甘氨酸)可达到这一效果。

                    发明概述

因此，依照本发明，为防止因容器壁吸附而引起TPO滴度减少提供了一种方法，所述容器装有包含不具有糖链部分的TPO蛋白的组合物，该方法包括给组合物添加至少一种药用添加物，所述添加物选自蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖表面活性剂，聚乙烯醇聚乙二醇和氨基乙酸。

本发明还提供一种含TPO的组合物，它包含不具有糖链部分的TPO蛋白及至少一种选自蛋白，纤维素衍生物，硫酸化多糖表面活性剂，聚乙烯醇聚乙二醇和氨基乙酸的药用添加物。

                   附图简述

图1是ELISA测定的表明TPO(1-163)/E.coli浓度与相应吸收值之间(450nm/650nm)关系的标准曲线。

图2表明当添加不同浓度的人血清白蛋白(HSA)时，TPO(1163)/E.coli的回收百分率随时间的变化。

                     发明详述

本发明的TPO可以用具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的蛋白，该蛋白不具有糖链部分，只要产品是高纯度的分离的蛋白，其制备方法没有具体限制。本发明所应用的TPO也可以是这样一种蛋白，它包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列在SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列中有部分修改(通过替代、删除、插入和/或添加)，但不具有糖链部分，条件是它保持TPO活性。

换言之，也可应用氨基酸序列基本上为SEQ ID NO：1中所示但不具有糖链部分的蛋白。术语“氨基酸序列基本上为SEQ ID NO：1所示指除SEQ ID NO：1中的氨基酸序列外还包括SEQ ID NO：1中的氨基酸序列经部分替代，删除，插入和/或添加而形成的氨基酸序列，只要仍保持TPO活性即可。