[发明专利]用HTRA启动子在减毒细菌中表达异源蛋白

说明书

本发明涉及DNA构建物，含有该构建物的可复制表达载体，含有该构建物的减毒细菌和含有所述细菌的疫苗。

近年来出现了新一代的口服沙门氏活菌疫苗，这些疫苗是基于通过在细菌的芳香氨基酸生物合成途径的基因中引入不可逆突变而减毒的沙门氏菌株。这种菌株公开于例如EP-A-0322237中。前述口服沙门氏活菌疫苗正显示为人和动物沙门菌病的有希望的疫苗，它们还可有效地用作向免疫系统输送异源抗原的载体。重组沙门氏菌疫苗已被用于输送病毒、细菌和寄生虫抗原，激发对重组抗原的分泌、体液和细胞介导的免疫应答。作为单剂口服多疫苗输送系统，重组沙门氏菌疫苗显示出很大的潜力[C.Hormaeche等，FEMS Symposium No.63，Plenum，NewYork；pp71-83，1992]。

在重组沙门氏菌疫苗的开发中有些问题需要克服。主要的考虑是重组抗原在沙门氏疫苗中获得高水平的表达，以便足以引发免疫应答。但是外源抗原的失调高水平表达可以是毒性的并影响细胞的生存力[I.Charles and G.Dougan，TIBTECH8，pp117-21，1990]，致使该疫苗无效或造成重组DNA的损失。已经描述了这一问题的几种可能的解决办法，例如从带有必需基因、“开-关”启动子的质粒中表达或将外源基因引入沙门氏菌基因组中。

克服上述问题的另一方法可能是利用一种在体内可诱导的启动子，一种这样的启动子是大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子nirB，它在厌氧生活下被诱导。在我们早先的国际专利申请PCT/GB93/01617中描述了含有用带nirB启动子的构建物转化之细菌的疫苗组合物。

本发明涉及含不同的可诱导启动子DNA构建物的制备，该启动子为编码一种应激诱导蛋白的htrA基因的启动子。

对htrA基因的描述见于K.Tohnson等Mol.Microbiol.1991；5：401-7和其中所引的参考文献中，这是编码热激蛋白之基因的一个实例，在温度升至42℃以上时产生所述蛋白。

因此，本发明第一方面提供含有与编码一种或多种异源蛋白的DNA序列有效连接的htrA启动子序列的DNA构建物。

在一种实施方案中，本发明提供一种上述定义的DNA构建物，其中htrA启动子与编码两种或多种异源蛋白之融合蛋白的DNA序列有效地连接。

组成融合蛋白的蛋白间可借助一柔性绞链区连接。

另一方面，本发明提供一种含有与编码第一和第二异源蛋白的DNA序列有效连接的htrA启动子的DNA构建物，其中第一异源蛋白是一种含破伤风毒素片段C或其一个或多个表位的抗原序列。

另一方面，本发明提供一种含有如上定义的DNA构建物的适用于细菌的可复制表达因子。

另一方面，本发明提供一种融合蛋白，优选基本纯的融合蛋白，即由如上所定义的构建物所表达的融合蛋白。

另一方面，本发明提供一种制备减毒细菌的方法，包括用如上所定义的DNA构建物转化一种减毒细菌。

还有，本发明提供一种含有如上所定义DNA构建物的宿主细胞，如一种细菌细胞。DNA构建物可以染色体外形式存在，如质粒中，或可以按本身已知的方法整合在宿主(如细菌)染色体中。

本发明还提供一种含有如上所定义的减毒细菌或从中表达的融合蛋白以及药学上可接受载体的疫苗组合物。

第一和第二蛋白优选是异源蛋白，尤其是多肽免疫原；例如它们是源自病毒、细菌、真菌、酵母或寄生虫的抗原序列。具体讲，优选第一蛋白是一种含有破伤风毒素片段C或其表位的抗原序列。

第二蛋白优选是一种病原生物的抗原决定簇。例如，这种抗原决定簇可以是源自病毒、细菌、真菌、酵母或寄生虫的抗原序列。

作为第一和/或第二异源蛋白的病毒抗原序列的实例是源自以下的序列：一种类型的人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV-1或HIV-2，HIV(如HIV-1或HIV-2)的CD4受体结合位点，甲、乙或丙型肝炎病毒，人鼻病毒如2型或14型，单纯疱疹病毒，2或3型脊髓灰质炎病毒，口蹄疫病毒(FMDV)，狂犬病毒，轮状病毒，流感病毒，柯萨奇病毒，人乳头瘤病毒(HPV)如16型乳头瘤病毒、其E7蛋白及含有E7蛋白或其表位的片段；和猴免疫缺陷病毒(SIV)。