[发明专利]抗人活化血小板单克隆抗体，其制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种新的单克隆抗体，特别是涉及抗人活化血小板单克隆抗体(MAb)SZ-51，其制备方法及在人或动物动脉血栓影像诊断和导向溶栓治疗中的应用。

1975年由Kohler和Milstein创立的单克隆抗体技术是分子免疫学发展上的一个重要里程碑，用此技术生产的MAb在疾病的诊断、治疗等方面显示了广阔的应用前景。然而，鼠源性单克隆抗体(以下有时简称为单抗)对人体具有免疫原性且抗体分子量较大，不易从肾脏中排泄，从而限制了其在人体内的广泛应用。1984年Morrison首次应用基因工程技术将MAb可变区基因与人恒定区基因连接，这种重组的嵌合体应用于人体大大减少了免疫原性。另外，通过基因工程技术还可制备抗体的最小功能片段，如FV、单链FV(ScFV)，小片段FV应用于人体既可渗透到血栓组织深部，又可加快其从肾脏中排泄，减少了单抗在血液中的积聚从而亦减少了免疫原性。可见，单克隆抗体可变区基因的克隆已成为制备基因工程抗体的关键。

Taub等人(J.Biol.Chem.1989；264：259-265)报道了一种抗人活化血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa复合物单抗PAC1的可变区基因序列。发现PAC1单抗重链可变区内CDR₃中含有与纤维蛋白原相似的RYD序列，该CDR₃(21肽)能竞争性地抑制纤维蛋白原与(GP)IIb/IIIa的结合，进而抑制血小板的聚集。故PAC1单抗中CDR₃21肽可用来对活化血小板的聚集，对富含活化血小板的血栓进行导向显像与导向溶栓。动物实验表明，人工合成的PAC1单抗CDR₃21肽用放射性核素^99mTc标记后，能快速进行血栓显像(Knight Lc，et al：J Nucl Med 1994；35：282-288)。1992年，Tomiyama等(J.Biol.Chem.1992；267：18085-18092)亦克隆了抗血小板(GP)IIb/IIIa复合物的单抗OP-G2的可变区基因，并发现OP-G2单抗重链可变区CDR₃中含有RYD序列，该多肽序列也能抑制血小板的聚集。但与PAC1单抗不同的是，OP-G2单抗及其多肽序列除了与活化血小板结合外，还可与静止的血小板结合。

目前尚未见有报道关于抗活化血小板α颗粒膜蛋白(GMP)-140单抗可变区基因序列。1992年我们研制了第51株单抗，为抗人活化血小板α颗粒膜蛋白(GMP)-140单抗，为此命名为“苏州51号”，即SZ-51。我们通过基因克隆技术获得了该单抗SZ-51可变区基因序列，该序列不同于其他任何一种抗人活化血小板单抗。SZ-51单抗特有的可变区基因序列决定了该单抗与活化血小板GMP-140特异结合的特性，因而该可变区基因序列可用来构建人源化单抗，进行重组表达。

本发明提供了一种抗人活化血小板(GMP-140)单克隆抗体SZ-51的可变区基因序列，同时提供了含有该基因序列的原核细胞与真核细胞表达载体以及相应的工程细菌株与细胞株。表达的产物为SZ-51单抗可变区基因与人IgG恒区基因重组的人源化单抗。这种重组的单抗识别的抗原为活化血小板膜表面特有的颗粒膜蛋白(GMP-140)，因此与放射性核素^99mTc标记后，能很好地进行血栓导向显像；与溶栓药物化学偶联后，能显著提高溶栓效率。因此，故基因重组人源化的SZ-51单抗可用于临床，作为导向载体，对血栓性疾病进行导向血栓显像诊断与导向溶栓治疗。