[发明专利]鲍鱼人工免疫物质的制备方法

说明书

本发明涉及一种把微生物培养物作为有效成分制成各种有用产品的方法。

目前在我国人工养殖鲍鱼的育苗过程中，鲍苗的死亡率极高，甚至可达95％，为此的们采用抗菌素来控制一般抗菌素的价格都比较高，而且每种抗菌素只对部分细菌有抑制作用，既使对某种细菌有效的抗菌素由于长期的使用也产生了抗药性，因此必须加大药量，这不仅大幅度地增加了鲍鱼成本，而且又加剧了海水的污染。陆地养鲍采用流水法，药浴时间短、用药次数少、药效就更不明显了。特别是由于水温、水质等变化每年甚至每个月鲍鱼的病因都不同这样用药治疗是很难的。

鉴于上述现有技术中的不足之处本发明的目的在于提供一种能提高鲍鱼自身免疫力使它们能抵抗各种疾病的较廉价的人工免疫物质的制备方法。

本发明的目的可通过以下措施来实现：鲍鱼人工免疫物质的制备方法，其特征在于：死菌苗注射液及菌饵的制备方法是：将从病鲍中分离的病原菌接种于肉汤蛋白胨的培养基上，经6～10小时培养用自制的接种棒接种于胰蛋白胨琼脂培养基中，于20～35℃培养12～26小时，用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24～120小时，离心，用无菌生理盐水稀释成10⁴～10¹¹个/毫升的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.5～1.5亿个/克的菌饵。活菌苗注射液及菌饵的制备方法是：将经过30左右次连续传代的菌种皮下、腹腔注射进兔子和鲍鱼的体内检查毒性，确认毒性很小后采用上述方法培养，用无菌生理盐水稀释成0.1×10⁴～0.1×10⁸个/毫升的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.1×10⁶～0.1×10¹⁰个/克的菌饵。脂多糖(Lps)的制备方法是，用改良的Wetphal方法提取病原菌的LPS，其注射液用量小于1.5mg/ml，饵料用量小于1.5mg/克。

几年来经多方面的探索和研究现已基本查明引起鲍鱼大批死亡的原因绝大多数是弧菌(Vibriosp.)所致。该弧菌包括有溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaenolyticus)，费尼斯弧菌(V.furnissii)、鳝弧菌(V.anguillarum)、河流弧菌II(V.flavialis)。另外还有假单胞菌属(psedomonas.sp)和气单胞菌属(Aeromonas.sp)。

上述这些细菌在鲍鱼体上引起的病症从体征上来区分有两种，其一是有明显体征的，如脓胞病。患该病的鲍鱼足部肌肉上出现微隆起的白色疱，当破裂后流出白色脓汁并留下2～5mm的深孔。它导致鲍的附着力减弱，直至身体翻转死亡。镜检脓汁发现除鲍的组织细胞外只有一种单生鞭毛短杆菌，经鉴定为河流弧菌II。其二是无明显体征的，患该病的鲍鱼食欲不佳，消化功能减弱，附着力差。该病的发病率和死亡率极高。引起该病症的有弧菌、假单胞菌属和气单胞菌属。

细菌的分离首先对有明显体征的病症的鲍鱼用70％乙醇擦拭患部及周围，然后用灭菌的解剖剪切开病灶，即刻用灭菌吸管吸取脓汁进行稀释。对于无明显体征的病症，取刚死亡鲍的足和消化道消毒、灭菌后，放入灭菌的研钵中磨碎，然后放入带有玻璃珠的瓶中。同样取生长正常的无病鲍作对比试样。将所取样品接入改良肉汤(其中氯化钠为1.0～2.5％)、改良胰琼脂(其中水为海水)培养基中，于17～35℃温箱中培养2～7天后观察记录菌落形态并分离优势菌。

人工感染取分离出的并经纯化的细菌置于肉汤琼脂斜面上，于17～35℃培养24小时。用灭菌的生理盐水分别洗下菌苔，离心洗涤后分别制成2×10⁶个/ml和4×10⁸个/ml活菌(采用平板稀释法、血球计数法测定菌数)，然后给不同生长发育期的鲍鱼注射和制成菌饵投喂，对照组注射生理盐水。观察七天后从有病症和死亡的鲍中分离菌株，此菌作为病原菌，并作为人工免疫的抗原。

通过观察分析患脓胞病鲍的脓汁和其它病症的病鲍的血淋巴认为鲍鱼体内有吞噬功能，能进行免疫。

鲍鱼和细菌凝集性的证明：