[发明专利]一种用于测定人Ⅲ型前胶原的试剂盒及其测定方法

说明书

本发明涉及的是医药诊断试剂，特别是一种在放射免疫法测定下的诊断肝纤维化的人Ⅲ型前胶原hPCⅢ诊断试剂，其制备方法和其在放射免疫测定中的使用方法。

据认为肝纤维化是各种慢性活动性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，在肝硬化进一步造成肝实质细胞严重损害后，才能被肝功能实验确诊，但一般常规肝功能试验无法诊断肝纤维化和早期肝硬化。目前临床主要依靠肝活检来判断，但此方法为创伤性检查，且受穿刺部位的局限，并且难以进行肝纤维化进展的动态观察。根据肝硬化乃至肝癌的形成和发展过程，世界肝病专家认为阻止或减慢肝纤维化的发生将会治愈大多数慢性肝病患者。因此，早期诊断肝纤维化特别是在临床上建立肝纤维化的可靠标志物对于防止肝硬化的形成和发展具有非常重要的意义。

近年来，国内外许多学者报道，血清Ⅲ型前胶原肽(Procollagen type Ⅲ Peptide,PⅢP)是诊断肝纤维化较好的血清学指标。测定方法多采用放射免疫分析法，所用抗原从动物胎皮中提取，如德国贝林格公司(Behr-ingwerke Co.)生产的PⅢP放免试剂盒中的关键材料PⅢP就是从牛胎皮中提取。也有从羊、鼠等胎皮中提取PⅢP的报道。其作为诊断肝纤维化标志物的依据是肝硬化早期以Ⅲ型胶原(Collagen type Ⅲ,CⅢ)增多为主，细胞在合成胶原时以前胶原形式分泌出细胞外，而血清PⅢP是Ⅲ型前胶原(Procollagen type Ⅲ,PCⅢ)经氨基端内切肽酶作用脱落下来的多肽链，所以测定PⅢP含量可以反映CⅢ的代谢状况。然而动物与人类胶原分子在结构上的一些抗原决定簇存在某些差异，必然对测定结果带来影响。此外，有些学者还发现肝细胞的炎症和坏死均可使在肝内存在的CⅢ裂解以致血清PⅢP值升高，因而血清PⅢP值不一定提示胶原合成的增加，亦即是血清PⅢP值诊断肝纤维化会受到其他因素的影响而不准确。此外，目前从国外进口PⅢP放免试剂的价格非常昂贵，其具体的放免测定操作复杂，需经过复杂计算才可以得到病人血清中的PⅢP含量。

本发明的目的是：1．提供一种包括从人工流产的死胎皮肤中提取的人Ⅲ型前胶原(human Procollagen typeⅢ)即hPCⅢ，其抗体anti-hPCⅢ，同位素标记抗原¹²⁵Ⅰ-hPCⅢ的放免试剂盒；2．提供所述试剂盒的放射免疫测定方法。

由于上述目的，本发明存在以下两方面的内容。

一、一种用于放射免疫法测定人Ⅲ型前胶原的试剂盒，包括纯抗原试剂、抗体试剂、标记抗原试剂和分离剂；其特征在于：纯抗原试剂为人Ⅲ型前胶原hPCⅢ，抗体试剂为人Ⅲ型前胶原抗体anti-hPCⅢ，标记抗原试剂为标记抗原¹²⁵Ⅰ-hPCⅢ；其中：

1、所述纯抗原试剂hPCⅢ按法马西(Pharmacia)公司蛋白质标准检验达到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯，用电泳考马斯亮兰R250染色呈粉红色，电泳图谱观察为单一区带，经β-巯基乙醇还原后电泳图谱可见两条区带，分别代表肽链Proα_l(Ⅲ)和Pα_l(Ⅲ)，前者的迁移率为0.238，蛋白质分子量为19万，后者的迁移率为0.310，蛋白质分子量为17万；

2．所述抗体试剂anti-hPCⅢ为hPCⅢ免疫家兔获得，其工作液用0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA),2％(v/v)正常兔血清(NRS)及0.1M,pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制；

3、所述标记抗原试剂¹²⁵Ⅰ-hPCⅢ用1％(w/v)BSA,0.1M,pH7.4的PBS配制成浓度为每100微升液体每分钟γ-射线计数值(cpm/100μl)30000；

4、分离剂为0.1M,pH7.4的PBS配制6％(w/v)聚乙二醇(PEG)和羊抗兔抗血清(第二抗体)获得。

本发明有如下附图：

附图1为hPCⅢ的PAGE图谱；

附图2为SDS-PAGE图谱；

附图3为从胎皮中纯化hPCⅢ过程中的中间产物SDS-PAGE图谱；

附图4为肝活检纤维化程度与血清PCⅢ相关关系统计图；

附图5为病理肝纤维化分级为0级的病理标本的显微图像；

附图6为病理肝纤维化分级为轻级的病理标本的显微图像；

附图7为病理肝纤维化分级为中级的病理标本的显微图像；

附图8病理肝纤维化分级为重级的病理标本的显微图像。    

本发明所述试剂盒中的试剂的质量鉴定方法及结果如下：