[发明专利]一种用于测定人Ⅲ型前胶原的试剂盒及其测定方法

权利要求书

1．一种用于放射免疫法测定人Ⅲ型前胶原的试剂盒，包括纯抗原试剂、抗体试剂、标记抗原试剂和分离剂；其特征在于：纯抗原试剂为人Ⅲ型前胶原hPCⅢ，抗体试剂为人Ⅲ型前胶原抗体anti-hPCⅢ，标记抗原试剂为标记抗原¹²⁵Ⅰ-hPCⅢ及分离剂；其中：

(1)所述纯抗原试剂hPCⅢ按法马西公司蛋白质标准检验达到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯，用电泳考马斯亮兰R250染色呈粉红色，电泳图谱观察为单一区带，经β-巯基乙醇还原后电泳图谱可见两条区带，分别代表肽链Proα₁(Ⅲ)和Pα_l(Ⅲ)，前者迁移率为0.238，蛋白质分子量为19万，后者的迁移率为0.310，蛋白质分子量为17万；

(2)所述抗体试剂anti-hPCⅢ为hPCⅢⅡ免疫家兔获得，其标准工作液用0.1％(w/v)牛血清白蛋白BSA,2％(v/v)正常兔血清及0.1M,pH7.4的磷酸盐缓冲盐水PBS配制；

(3)所述标记抗原试剂¹²⁵Ⅰ-hPCⅢ用1％(w/v)BSA,0.1M,pH7.4的PBS配制成浓度为每100微升液体每分钟γ-射线计数值(cpm/100μl)30000；

(4)分离剂为0.1M,pH7.4的PBS配制6％(w/v)聚乙二醇和羊抗兔抗血清为第二抗体获得。

2．一种利用权利要求1所述的试剂盒测定肝纤维化的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

(1)100μl标准液或待测病人血清标本中加入100μlanti-hPCⅢ后，4℃放置42～48小时；    

(2)加入100μl计数值为30000cpm的¹²⁵Ⅰ-hPCⅢ溶液，4℃放置6小时；

(3)加入分离剂200μl，室温放置30分钟；

(4)4000转/分，4℃-10℃条件下离心30分钟；

(5)吸弃上清液后用γ计数仪测定沉淀物的放射性计数值，其值用B_x表示，下标x代表不同浓度标准工作液或病人标本；

(6)在半对数坐标纸上以〔(B_标准液-B_NSB)/(B_o-B_NSB)％为纵坐标，B_o代表最大结合，B_标准液代表标准液结合，B_NSB代表非特异性结合，以hpcⅢ标准液浓度为横坐标绘制标准上作曲线；

(7)用〔(B_病人标本-B_NSB)/(B_o-B_NSB)％反查标准工作曲线即可得到病人血清中hPCⅢ含量。