[发明专利]指示菌法平板快速筛选糖化酶产生菌新方法

说明书

本发明属于利用指示菌平板快速筛选糖化酶产生菌的新方法。

在发酵工业中，大量耗用糖化酶，筛选糖化酶产生菌工作相当繁杂，因而，妨碍了糖化酶的生产。传统筛选糖化酶产生菌的方法是利用次亚碘酸盐法，该方法是化学测定法。它除要求发酵滤液作样品外，也无法排除α-淀粉酶和葡糖苷转移酶的影响，更无法应用于能筛选大量菌株的单菌落琼脂柱育种。1977年，J.Meyrath创造一种能去除葡糖苷转移酶影响的筛选方法，其本质也是化学检测法。流程是：菌块柱（置于平板上） (注入麦芽糖液保温2小时)/() 反应混合液→移到薄板色层分析器 (干燥)/() 显色→染色→挑出不产葡糖苷转移酶的菌落。这方法虽可排除葡糖苷转移酶的干扰，但难以区分每个菌落间糖化酶含量的差别，且流程、工序繁杂。

本发明的目的是提供一种指示菌法快速筛选糖化酶产生菌的新方法。它既能排除α-淀粉酶和葡糖苷转移酶的影响，又能在平板上区分大量单菌落琼脂柱产酶量差别;同时，设备简单，筛选过程简易快捷。

本发明的原理是：琼脂柱的体积是相等的，所含营养成份也是相同的。当生长在它上面的不同菌株的生产性能不同时，分泌在琼脂柱里的糖化酶量也不一样。因而，检测的结果也不一样。根据对糖化酶敏感的指示菌形成的生长圈大小与菌落直径的比值，筛选出较优菌株。

本发明的工艺过程是：单菌落琼脂柱或菌块柱 (加入指示菌液)/() 平板检测→挑选出最优菌落。

具体步骤分述如下：

一、指示菌的培养：指示菌种为：产肮假丝酵母（Candida    utilis），热带假丝酵母（Candida    trapicalis），解脂假丝酵母（Candida    lipolytica），乳酒假丝酵母（Candida    kefyr），克鲁斯假丝酵母（Candida    krusei），郎必克假丝酵母（candida    Iambica）。上述菌种的共同特征可在中国科学院微生物研究所“常见与常用真菌编写组”编写的《常见与常用真菌》一书P146找到。菌种可向中国科学院微生物研究所菌种室购买。

指示菌培养基成份：马铃薯200克，葡萄糖20克，CaCO₃0.5克，K₂HPO₄0.05克、MgSO₄0.05克，蒸馏水1000ml。马铃薯去皮煮沸20～30分钟，加入葡萄糖、无机盐和20克琼脂，溶化后调pH为6.5。每支12×180mm试管装8ml。1.1公斤压力灭菌30分钟后摆斜面，备用。

菌种培养：在28℃培养24小时，菌苔半透明至乳白色。

菌液制备：把消毒蒸馏水注入每支试管，每管5～10ml，用接种环刮洗液倒入消毒过的三角瓶里，置4℃冰箱保存备用。该菌液用72型分光光度计（510mm）测定OD值为0.25～0.26。

二、单菌落琼脂柱及菌块柱的制备和检测：

琼脂柱培养基：玉米粉1～5%，黄豆饼粉0.5～2%，麸皮0.1～0.5%，K₂HPO₄0.02～0.1%，琼脂1.5～2.0%。

单菌落琼脂柱制备：把上述培养基溶化，每个9cm平皿倒入25ml。把待筛选菌株按常规法分离，每皿约出现30个菌落，适温培养至初见菌落时，用打孔器打出单菌落琼脂柱，在95%湿度下适温培养1～2天，长出孢子后，即可进行检测。

菌块柱制备：把上述培养基按每平皿25ml倒好冷却后，即可用打孔器打出琼脂柱，然后，在每个柱面上接种各个待选菌株，置95%湿度下适温培养2～4天。

检测培养基及检测平板制备：（NH₄）₂SO₄0.1～0.5%，KH₂PO₄0.02～0.1%，MgSO₄0.01～0.05%，酵母膏0.005～0.02%，天门冬素0.005～0.015%麦芽糖1～3%，洗过琼脂2.5～3.0%。将上述药物（除麦芽糖和琼脂外）以蒸馏水配制后，每250ml三角瓶盛100ml，灭菌备用。倒平板前才加麦芽糖和琼脂溶化，冷至50℃时加入指示菌液5～10ml，混匀后，立即倒入消毒过的平板里，100ml/个，冷凝。