[其他]在链霉菌中制备异种蛋白的方法

说明书

公开号为0，161，629的欧洲专利申请（EP-A）和南非专利85/3672公开了使用编码α-淀粉酶抑制剂tendamistat之信号肽（前肽）的DNA，而使链霉菌细胞分泌一种多肽，具体地说就是tendamistat的方法。原则上，合适的DNA可从每种能够产生tendamistat的菌株中得到，但最好选用依德国专利公开3，331，860中实施例3之方法所得到的DNA。

业已发现，也可通过构建融合蛋白基因而在链霉菌中制得异种蛋白，其中表达所需蛋白的结构基因与tendamistat基因（编码链）的3′末端相偶联，而该基因是已经过适当地修饰的。对tendamistat基因的修饰特别可包括C-末端的缩短。

在EP-A0，161，629中描述了编码tendamistat的DNA（即表1所示的DNA序列C）。该结构基因含有几个限制性内切酶的切点，这些酶可用来修饰被编码的氨基酸顺序。适宜的切点有处在三联体31和32区域内的BstⅡ切点、三联体43和44区域内的StuⅠ切点，以及三联体52和53区域内的Sau3    A切点。有可能通过掺入合适的连接子而使一个或多个其它氨基酸插入到这些切点中，以除去这些切点之间的DNA片段，或通过掺入终止密码子来编码缩短了的氨基酸顺序。此外，有可能通过位点特异性诱变以插入、取代或除去任何所需氨基酸。用这种方法可得到具有α-淀粉酶抑制作用的蛋白，以及无此活性但仍可与相应受体反应的蛋白。

本发明还涉及合适的基因结构、含有这些基因结构的载体、用这些载体转化的链霉菌细胞、分泌的融合蛋白以及它们在制备异种蛋白和tendamistat衍生物上的应用。下面将详述本发明的优选实施方案并在权利要求书中加以限定。

图1至图4描述了本发明之某些质粒的构建。

图1表明编码融合蛋白的杂交质粒pKK310的制备，其中在tendamistat氨基酸顺序部分后面按有一包含7个氨基酸的桥接部分，其后是猴胰岛素原的氨基酸顺序。

图2表明起始于质粒pKK310的表达质粒pTF1的构建。

图3表明质粒pRS10-其中在tendamistat基因部分后面接有来自pUC18的多连接子-的构建，及其在表达质粒pTF10内的重建。“mcs”表示pUC18的多连接子区域（多克隆位点）。

图4表明编码融合蛋白的质粒pKK400的构建，其中在全部tendamistat氨基酸顺序后面接有一包含7个氨基酸的桥接部分，其后是猴胰岛素原的氨基酸顺序，同时显示了pKK400重建为表达质粒pGF1的构建图。

这些图都不是接真实比例绘制的。

根据本发明得到的融合蛋白（它们是从细胞中排出的）的优点在于易于从培养滤液中分离出来。可用本身已知的方法，如通过吸附或离子交换层析和/或凝胶过滤进行分离。

可用本身已知的方法，通过酶促裂解或化学裂解释放出所需异种蛋白（参与融合者）。

就此而论，裂解的类型主要取决于所需蛋白的氨基酸顺序。在许多情况下，最好将桥接或连接部分插在tendamistat序列和所需蛋白之氨基酸序列之间的切点中。例如，如果所需蛋白不含有蛋氨酸，则连接部分可表示蛋氨酸，于是可用氯化氰或溴化氰进行化学裂解。如果连接部分的羧基末端是半胱氨酸，成连接部分代表半胱氨酸，则可能进行半胱氨酸特异性酶促裂解或化学裂解，例如在特异性S-氰化反应之后进行化学裂解。如果桥接部分具有羧基末端色氨酸，或连接部分代表色氨酸，则可用N-溴代琥珀酰亚胺进行化学裂解。

在其氨基酸序列中不含Asp-Pro并且对酸足够稳定的所需蛋白，可作为具有该桥连部分的融合蛋白用本身已知的方法进行蛋白水解。水解后可产生含N-末端脯氨酸和C-末端天冬氨酸的蛋白质。因此，用这种方法有可能合成经修饰的蛋白质。

如果该桥接部分表示（Asp）n-Pro或为Glu-（Asp）n-Pro，n代表1～3，则可形成对酸不太稳定的Asp-Pro键。

也已公开了酶促裂解的实例，也可使用具有改善了特异性的修饰酶（参见C.S.Craik    et    al.，Science    228（1985）291-297）。如果所需的真核生物肽是胰岛素原，则所选用的肽序列最好是其中能被胰蛋白酶除去的氨基酸（Arg，Lys）是结合到胰岛素原的N-末端氨基酸（Phe）上的，例如Ala-Ser-Met-Thr-Arg，这样就有可能使用胰蛋白酶进行精氨酸特异性裂解。