[发明专利]无抗原性L-天冬酰胺酶的制备

说明书

本发明涉及制备生化药物的方法，特别是涉及底物保护化学修饰L-天冬酰胺酶制备无抗原性L-天冬酰胺酶的方法。

来源于大肠杆菌的L-天冬酰胺酶是分子量约为13.4万，4个相同亚基组成的蛋白质，能水解L-天冬酰胺为天冬氨酸和氨。由于该酶可以‘剥夺’某些肿瘤细胞所必须的营养源之一-L-天冬酰胺，从而抑制肿瘤细胞的生长。国内外临床资料表明（Compbell，H.a.et    al.Bio-chemistry    6.721    1967），该酶是治疗淋巴性白血病和恶性淋巴肿瘤的有效药物。目前已有商品出售。

但是，该酶是来源于大肠杆菌的异体蛋白，存在酶疗法中常见的两个难以解决的问题。即该酶在人体内半衰期短，很快从血液循环中排除;非经口投药后，连续投用会刺激人体免疫系统，产生抗体，引起有害的免疫反应，被迫终止用药，影响医疗效果，严重时造成生命危险。其原因是该酶分子表面存在7～8个抗原决定部位，其中每个部位均包含2～3个氨基酸残基。这些部位被人体视为‘异己’而被识别，排斥，产生免疫过敏反应。

为了解决抗原性问题，自1975年以来曾用多种化学修饰法，如用亚硝酸（Wagner，O.et    al，Biochem，Biophys，Res.commun，37，383，1969）、琥珀酸酐（Shifrin，S.et    al.J.Biol.Chem.247，1048，1972）、三硝基苯磺酸（Parrol，O.L.et    al.，Biochem，Biophys，Acta，445， 437，1976）、为了降低该酶抗原性做了大量的研究。然而，结果表明，这些小分子修饰剂对解决抗原性几乎是不可能的。1977年以后开始用水溶性大分子如多聚DL-丙氨酸（Uren，J.R.et    al.，Cancer    Res，39，1927-1933，1979）、右旋糖酐（Wileman，T.T.et    al.，J    Pharm.Phar-macol    33（suppl）85，1981）、白蛋白（Yagura，T.et    al.，Int.Arch.Allergy    Apply.Immenol，64（1），11-18，1981）、单甲氧基聚乙二醇（Matsushima，A.et    al.，Chem.Lett，7，773，1980）等修饰该酶。发现单甲氧基聚乙二醇（PEG）是较理想的解除抗原性的修饰剂。但遗憾的是当抗原性完全解除时，该酶活力仅保留0.02%。1982年日本稻田等人改进了单甲氧基聚乙二醇的活化方法获得的修饰酶，当抗原性完全解除时，酶活力可保持11%（西村    裕之，和田    博，稻田地    佑二，癌と化学治疗法11（10）;2227-2235，1984）。这是当前解决该酶抗原性的最好结果。但是我们认为这种结果用于生产和临床还不够理想，酶活力的严重损失不仅会提高生产该酶的成本而且还将影响临床效果。

为了在延长该酶体内、体外半衰期和完全解除抗原性的同时，尽可能高地保持酶活性，有利于该酶的生产和临床应用，本发明人改进了上述修饰方法，采用底物L-天冬酰胺保护酶活性部位的单甲氧基聚乙二醇修饰方法。

本发明人发现，尽管氨基并非活性基团，但由于单甲氧基聚乙二醇（PEG）修饰酶活力损失很大，因此考虑在活性部位附近可能有氨基存在，修饰结果影响了与底物结合的能力，或改变活性部位的构象，致使酶活性损失。因此，采用底物或底物类似物保护活性部位的方法，以防止活性部位附近的氨基被修饰，从而保护了酶的催化功能。

总之，本发明方法的特征是使该酶活性部位在其底物L-天冬酰胺的保护下，用活化的单甲氧基聚乙二醇（PEG）共价修饰该酶自由氨基，使酶活得到较大程度的保护，从而制得即能在较大程度上保留酶活力，又可以完全解除酶蛋白质抗原性的修饰L-天冬酰胺酶制剂。

现对本发明的方法详细描述如下：

L-天冬酰胺酶的分离及纯化：

按照Helon等人的方法（Helon，A.et    al.Biochemistry    8，385，1969）从大肠杆菌AS.1.357菌体中分离得到该酶粗品，然后再经过DEAE-Sephadex，A50用0.02M    PH8.0的磷酸缓冲液及0.2M    PH6.0磷酸缓冲液梯度洗脱，收集活力峰组份，透析;又经AH-Sepharose    4B吸附，用含有0.25M    NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液（PH8.0）梯度洗脱，收集活力峰组份，透析，冻干，得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的L-门冬酰胺酶产物。

L-天冬酰胺酶修饰剂的制备：