[其他]人红血球生成素基因在稳定转染的哺乳动物细胞中的高水平表达

说明书

本发明一般地涉及基因工程领域，具体说与重组基因的糖蛋白产物表达有关，更具体地说与从稳定转染的细胞中高水平地表达有生物活力的人红血球生成素有关。

红血球生成素这一激素在调节红血球生成、红血细胞的形成以及由贫血导致的红血球生成素缺乏中起着重要作用。由于缺少纯的材料，对这个激素做详细研究以及试图用它进行替补治疗一直都很困难。

人红血细胞的产生，需要肾脏分泌成熟糖蛋白形式的红血球生成素。在恒态时，这个激素在循环血液中浓度为每毫升10至18毫单位（128-230微微克），在严重的组织供氧不足（缺氧）刺激下，它的水平可以增加一千倍。提高激素水平可触发骨髓中感受干细胞群的增生和分化，激活成熟红细胞中血红蛋白的合成，加速红细胞从骨髓释放进入循环，从而增加红细胞量，改善供氧不足的局面。缺乏红血球生成素的病人如慢性肾脏病人，常患有严重的贫血症。

红血球生成素是一个34-38千道尔顿的糖蛋白，分子量的约40%是糖类提供的。至少一个二硫桥是活力所需的，对此激素的结构所知甚少，其合成的详情也未全清楚。最近分离到的CDNA和基因组克隆，提供了分析红血球生成素产生的调节控制的机会，但是，还没有表达足够数量的有生物活力的人红血球生成素以用于替补治疗。

按照本发明公开的内容，有生物活力的人红血球生成素可以由稳定转染的哺乳动物细胞系进行高水平表达（每升上清液超过二百万名义滴度单位），这就为临床应用纯的人红血球生成素提供了巨大的来源。红血球生成素的这一惊人的高水平表达，是通过用人红血球生成素基团的ApaⅠ限制片段转染宿主细胞系实现的。ApaⅠ限制片段的意义链有图1所示的核苷酸序列。

图1表示含有人红血球生成素基因序列的2426个碱基对的ApaⅠ限制片段;

图2绘出了含有比2426个碱基对的ApaⅠ限制片段的有代表性的质粒表达载体（pD11-Ep）;

图3描绘的是另一个带有ApaⅠ限制片段的表达载体（pBD-Ep）。

在较好的实施方案中，如图1所示的通过基因工程构建的ApaⅠ限制片段被插入如图2和图3所示的哺乳动物表达载体中，然后将表达载体引入哺乳动物细胞系以发展稳定转染的细胞，产生大量有生物活力的人红血球生成素。所选择的人红血球生成素基因的ApaⅠ限制片段要能最高效率地转录红血球生成素信使RNA，有效地转译RNA和进行转译后的修饰，以生成具有生物活力的成熟红血球生成素糖蛋白。具体地说，重要的是将红血球生成素基因5′端干扰序列除去，而保留增强子序列。为了保存有潜在价值的增强子序列，ApaⅠ限制片段中的内含子也被保留。在基因的3′端某些非转译序列也被保留，    使推测的调控序列最适化。由ApaⅠ片段提供的增强表达为以下实例所证实，在下述实例中，该片段与两个启动子和两个细胞系合用均得到稳定的高水平表达的红血球生成素。

提出下列实例是用以阐述发明的优越性，并帮助普通的专门技术人员掌握和应用本发明。这些实例无论如何都不是企图限制本发明公开的范围，或本专利证书所提供的保护。

实例1.基因克隆的提取

在λ噬菌体中构建的人基因组文库（Cell，15：1157-1174，1978）用低严紧度杂交条件及在Cell，38：287-297，1984（特此引证）中所述的寡核苷酸探针混合物进行筛选。

寡核苷酸混合物系用Applied Biosystems合成仪制备，用³²P-ATP及T4多核苷酸激酶作末端标记。设计的合成寡核苷酸相应于氨基末端部分的氨基酸序列：

H₂N-Ala-Pro-?-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-

Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-?-Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala

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